방법 논문

초파리 유충 상상 디스크 해부: 상피 발달을 관찰하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Morimoto, K. and Tamori, Y. Drosophila Imaginal Disc Epithelia에서 종양의 유도 및 진단. J. Vis. 특급 (2017).

초파리 상상 디스크를 염색할 때, 디스크가 노출되어 있지만 몸에 붙어 있는 부분을 거칠게 해부하는 경우가 많습니다. 염색이 완료되면 관심 디스크가 분리되어 장착됩니다. 예제 프로토콜은 날개 상상 디스크 해부 및 장착 절차를 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

1. 유충 해부

  1. 나무 막대기나 뭉툭한 집게로 떠돌아다니는 세 번째 instar 유충을 수집하고, 형광 실체 현미경으로 적절한 형광 마커(예: EGFP)로 유전자형을 분석한 다음 PBS(인산염 완충 식염수)가 있는 해부 접시에 넣습니다.
  2. PBS에서 2mL 플라스틱 이송 피펫으로 피펫팅하여 유충을 세척합니다.
  3. 한쪽 집게로 유충의 중심을 꼬집고 다른 집게로 몸을 반으로 찢습니다.
  4. 한쪽 집게로 앞쪽 절반의 입 고리를 꼬집고 다른 집게로 입을 몸 쪽으로 밀어 몸을 뒤집습니다.
  5. 타액선이나 뚱뚱한 몸과 같은 불필요한 물질을 집게로 제거하십시오.

2. 고정 및 항체 염색

  1. 절개된 유충 몸체의 앞쪽 절반(상상의 날개 디스크 포함)을 1.5mL 플라스틱 튜브로 옮기고 1mL의 Fix 용액(PBS의 4% 포름알데히드)에 10분 동안 실온에서 어두운 곳에서 부드럽게 회전시키며 고정합니다.
    주의: 포름알데히드는 독성이 있으며 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑과 의복을 착용하십시오.
    참고: 이 부분에서 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 어두운 곳에서 실온의 너트에서 수행됩니다.
  2. Fix 솔루션을 제거하고 폐기합니다. PBT 1mL(PBS의 경우 0.3% Triton X-100)로 조직을 각각 15분씩 3회 세척합니다.
  3. PBT를 제거하고 PBTG 1mL(PBT에 0.2% 소 혈청 알부민 및 5% 일반 염소 혈청)를 첨가하여 실온에서 1시간 또는 4°C에서 밤새 차단하고 영양을 주입합니다.
  4. PBTG를 제거하고 PBTG로 적절하게 희석한 1차 항체 용액을 첨가하고(재료 표 참조) 4°C에서 하룻밤 동안 호팅합니다.
  5. 1차 항체 용액을 제거하고 1mL PBT로 조직을 각각 15분씩 3회 세척합니다.
  6. PBT를 제거하고 PBTG로 적절히 희석한 2차 항체 용액을 첨가합니다(1:400). 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 발효시킵니다.
  7. 2차 항체 용액을 제거하고 PBT 1mL로 조직을 각각 15분씩 2회 세척합니다.
  8. F-actin을 염색하려면 PBT를 제거하고 PBS에 적절하게 희석된 Phalloidin 용액을 추가합니다(1:40). 그런 다음 20분 동안 누테이트합니다. 팔로이딘 용액을 제거하고 PBT 1mL로 조직을 각각 15분씩 2회 세척합니다.
  9. 핵 DNA를 역염색하려면 PBT를 제거하고 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 용액(PBS에서 0.5μg/mL의 DAPI)을 추가합니다. 그런 다음 10 분
    주의: DAPI는 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑과 의복을 착용하십시오.
  10. DAPI 용액을 제거하고 PBT 1mL로 조직을 각각 15분씩 2회 세척합니다.
  11. PBS 1mL에 한 번 실온에서 10분 동안 헹굽니다.
  12. PBS를 제거하고 500μL의 100% 글리세롤을 사전 장착 매체로 추가합니다.

3. 현미경 슬라이드에 장착

  1. 2mL 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 염색된 조직을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
  2. 조직을 집게로 다른 현미경 슬라이드의 장착 매체 방울로 옮깁니다.
  3. 한쪽 집게로 절개된 조직의 끝을 잡고 다른 집게로 뇌와 눈 더듬이 디스크를 당겨 빼냅니다.
    참고: 절개된 뇌를 날개 상상 디스크 근처에 두도록 합니다. 뇌는 커버슬립이 날개 상상의 원반을 부수는 것을 방지하는 플랫폼 역할을 합니다.
  4. 날개를 분리하기 위해 상상 디스크는 한 집게로 절개 된 조직의 끝을 잡고 다른 집게로 신체 벽을 부드럽게 긁고 디스크를 뜯어냅니다.
    참고: 날개 상상 디스크를 찾기 어려운 경우 기관에서 뒤쪽에서 앞쪽으로 껍질을 벗깁니다. 날개 상상 디스크는 기관에 붙어 있습니다.
  5. 커버 슬립으로 상상의 디스크를 부드럽게 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오.4 ° C에서 보관하십시오.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
인산염 완충 식염수(PBS)와코162-19321
트리톤X-100와코Tel.: 168-11805
포름알데히드와코제064-00406
소 혈청 알부민시그마A7906
노멀 염소 세럼시그마G6767
장착 매체, Vectashield벡터 연구소H-1000
다피시그마D9542
마우스 안티 Dlg 4F3발달 연구 Hybridoma Bank4F3 디스크 방지 대형, RRID:AB_528203PBTG로 희석, 1:40
마우스 안티 MMP1발달 연구 Hybridoma Bank3A6B4, RRID:AB_5797803 1:1:1을 혼합하고 PBTG로 희석, 1:40
마우스 안티 MMP1발달 연구 Hybridoma Bank3B8D12, RRID:AB_5797813 1:1:1을 혼합하고 PBTG로 희석, 1:40
마우스 안티 MMP1발달 연구 Hybridoma Bank5H7B11, RRID:AB_5797793 1:1:1을 혼합하고 PBTG로 희석, 1:40
마우스 안티 아튜불린발달 연구 Hybridoma BankAA4.3, RRID:AB_579793PBTG로 희석, 1:100
알렉사 플루어 546 팔로이딘분자 프로브A22283PBS에서 희석, 1:40
염소 안티 마우스 IgG 항체, Alexa Fluor 546분자 프로브A11030PBTG로 희석, 1:400
플라이 스트레인
SD-갈4블루밍턴 초파리 주식 센터#의 8609UAS-EGFP와 재결합
업디-갈4블루밍턴 초파리 주식 센터#의 26796UAS-EGFP와 재결합
UAS-lgl-RNAi비엔나 초파리 RNAi 센터#의 51247
UAS-스크립-RNAi비엔나 초파리 RNAi 센터#105412
UAS-라스V12블루밍턴 초파리 주식 센터#의 64196
UAS-이키3SA블루밍턴 초파리 주식 센터#28817
HS증권 시세블루밍턴 초파리 주식 센터#6
Act>CD2>GAL4 (플립아웃 GAL4)블루밍턴 초파리 주식 센터#의 4780UAS-EGFP와 재결합
UAS-EGFP블루밍턴 초파리 주식 센터#의 5428X 염색체
UAS-EGFP블루밍턴 초파리 주식 센터#의 6658세 번째 염색체
UAS-다이서2블루밍턴 초파리 주식 센터#의 24650두 번째 염색체
UAS-다이서2블루밍턴 초파리 주식 센터#의 24651세 번째 염색체
VKG-GFPMorin 외. 2001GFP 단백질 트랩
년 호 시리즈 표시기 시리즈 시리즈

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