이 프로토콜은 Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌
한 것입니다.
1. 솔루션 및 재료 준비
- 다음 해결 방법을 준비합니다.
- SSM(Serum Supplemented Medium) 준비: 슈나이더의 초파리 배지는 10%의 열 불활성화 소 태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신으로 보완됩니다.
- 1x 트립신 효소(예: TrypLE Express Enzyme)의 분취액을 준비하고 실온에서 보관합니다.
- 파파인 분취량[50 U/mL]을 준비합니다(-20 °C에서 보관하고 한 번만 해동).
- 1x 인산염 완충액 식염수(PBS, 실온에서 보관)를 준비합니다.
- 액세서리 땀샘의 물리적 해리를 위해 여러 개의 화염 원형 피펫 팁을 준비합니다.
참고: 액세서리 땀샘은 처리되지 않은 플라스틱에 달라붙는 경향이 있으므로 취급할 때 낮은 유지력 팁을 사용하십시오. 화염 라운딩 과정은 팁 개구부를 줄이고 팁의 가장자리를 매끄럽게 만듭니다. 이는 세포막을 깎지 않고 펩티다아제 분해 후 효율적인 해리를 보장합니다.
- 날카로운 칼날로 200μL 팁 하나를 자르고 화염 위로 부드럽게 통과시켜 팁을 둥글게 만들어 개구부가 더 넓지만 2.7단계에서 취급하기에 매끄럽게 만듭니다.
- 여러 개의 1,000μL 팁 개구부를 1초 미만 동안 화염 근처로 통과시켜 개구부를 좁힐 수 있습니다. 과도하게 녹거나 막히지 않도록 팁을 약간 회전하십시오. 만들어진 팁을 좁은 것부터 넓은 것으로 정렬합니다. 이것은 흡인 속도의 타이밍을 맞춰 수행할 수 있습니다. 가장 좁은 팁의 효율성을 테스트하기 위해 AG의 소규모 샘플을 해리해 보십시오.
참고: 이 팁은 기계적 교반에 매우 중요합니다. 고품질의 화염 둥근 피펫 팁은 세포 생존력을 보존하면서 완전한 해리를 가능하게 합니다. 따라서 이러한 팁은 재사용 절차가 끝날 때 물로 철저히 세척됩니다. 이를 통해 매일 재현 가능한 해리가 가능합니다.
2. 부속샘 해부
- 20-25마리의 수컷 초파리를 얼음 위의 유리 접시에 담습니다.
- SSM에서 수컷 1명을 해부합니다. 생식관을 제거하고 사정관을 제외한 다른 모든 조직에서 부속샘 쌍을 제거합니다.
참고: 방출된 정자는 덩어리를 만들고 해리 과정을 방해할 수 있으므로 고환을 제거하십시오. 사정 전구를 제거하면 뜨 있을 때 다루기가 어렵습니다.
- 겸자를 사용하여 액세서리 땀샘을 실온에서 SSM으로 채워진 유리판으로 옮깁니다. 2.2-2.3단계를 20회 반복하여 SSM.
에서 20쌍의 땀샘 배치를 얻습니다.
참고: 이 단계는 15-20분 안에 완료됩니다. AG는 건강해 보여야 하며 땀샘 주변 근육층의 연동 운동이 보여야 합니다. GFP는 형광 현미경을 사용하여 모니터링할 수 있습니다.
- 액세서리 글랜드를 1x PBS로 옮겨 실온에서 1-2분 세척합니다.
참고: 더 나은 해리를 위해서는 PBS로 분비샘을 헹구는 것이 필수적입니다. 그러나 이 단계의 지속 시간은 세포가 PBS에서 스트레스의 징후를 보이기 때문에 제한되어야 합니다. PBS에서 해리된 2차 세포는 빠르게 팽창하고 사멸합니다.
- 해리 용액을 얻기 위해 20μL 파파인[50U/mL]을 180μL의 1x 트립신 효소에 희석합니다(확장 또는 축소하려면 각 남성에 대해 9μL의 트립신 효소와 1μL의 파파인을 유지). 겸자를 사용하여 부속 땀샘을 이 용액으로 옮깁니다.
- 부속샘(보조 세포 포함)의 끝을 근위부에서 분리합니다.가는 집게를 사용하여 선엽의 중앙을 단단히 조이고 두 번째 집게의 날카로운 끝으로 자릅니다. 부속샘의 근위부와 사정관을 제거하여 해리를 개선하고 세포 분류 시간을 단축합니다.
참고: 20쌍의 분비샘에서 원위부를 해부하는 데는 15-20분이 소요되며 펩티다아제에 의한 소화는 실온에서 시작됩니다.
- 모든 글랜드 팁을 절부한 후 1.2.1단계에서 준비된 특수 200μL 피펫 팁을 사용하여 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 땀샘을 다루기 전에 넓고 둥글며 젖어야 합니다.
참고: 부속 글랜드 조직을 피펫으로 만들려면 팁을 항상 적절한 용액(트립신 효소 또는 SSM, 이 목적을 위해 각각 하나의 튜브를 보관)으로 미리 적셔야 합니다. 오염을 방지하기 위해 샘플 사이의 팁을 조심스럽게 헹굽니다.