Island Assay: 초파리의 운동 거동을 평가하기 위한 고처리량 방법

초록

출처: Eidhof, I., et al. 초파리 섬 분석에서 운동 행동의 고처리량 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 초파리의 운동을 연구하는 데 사용되는 행동 방법인 섬 분석에 대해 설명합니다. Sample Protocol은 반자동 이미지 분석과 호환되는 분석 설정을 특징으로 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌

한 것입니다.

1. 섬 분석 상자의 구성

폴리메틸메타
1. 크릴레이트(PMMA)와 같은 견고한 재료로 만든 트레이를 준비하여 물층(즉, 수조)을 담습니다. 재료가 흰색이 아닌지 확인합니다.
   참고: 40 x 35 x 2.5cm³의 치수를 권장합니다(그림 1A).
2. PMMA와 같은 견고하고 투명한 재질로 만든 상자 (42 x 38 x 25cm³)를 준비하여 파리가 실험실 공간으로 탈출하는 것을 방지하기 위해 욕조 주변에 놓습니다. 실험자가 파리가 있는 바이알을 쉽게 다루고 섬에 떨어뜨릴 수 있을 만큼 충분히 큰 구멍(20 x 30cm²)을 측면에 놓습니다(그림 1A).
3. 방수가 되는 불침투성 재료(PMMA 또는 플라스틱)로 만들어진 10 x 15 x 2.5cm³ 치수의 고가 플랫폼을 준비합니다.
   참고: 이 플랫폼은 이미지 분석을 위한 우수한 대비를 보장하기 위해 균일한 흰색 표면을 가져야 합니다. 크기가 반드시 고정되어 있는 것은 아니지만 모든 파리가 처음에 플랫폼에 착륙하고 플랫폼 위를 걸을 기회를 얻을 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다(그림 1A).
4. 실험/촬영 세션 중 플랫폼의 위치 변경을 방지하기 위해 플랫폼을 욕조에 붙이거나 플랫폼 상자 내부에 추 또는 기타 무거운 물체를 놓아 플랫폼을 고정합니다.

2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치

1. 이미지 기록 소프트웨어 설치.
   1. 아일랜드 이미지 시리즈를 기록하기 위한 이미지 기록 소프트웨어를 다운로드하고(자료표 참조) 컴퓨터에 소프트웨어를 설치하십시오.
      참고: 이 프로토콜에 설명된 이미징 기록 소프트웨어는 Windows에서만 지원됩니다. 다른 사용자를 위한 대안이 재료 표에 추가되었습니다.

3. 섬 분석에서 테스트할 파리의 준비

1. 앞서 설명한 대로 추위 또는 이산화탄소(CO₂) 마취 하에서 각 실험 조건에 대해 단계적 파리를 수집합니다(1 - 2일 동안).
   1. 실험 조건당 최소 3개의 샘플 바이알을 준비하며, 각 바이알에는 약 15개의 단계적 파리가 포함되어 있습니다. 날개가 손상되지 않고 나이와 성별이 비슷한 파리만 사용하십시오.
      참고: 여기에 설명된 실험의 경우, 유전자형 w^-의 수컷 파리 15마리를 포함하는 5개의 샘플 바이알; Actin-Gal4/+(대조군) 및 w^-; Actin-Gal4/GD11950(tefu RNAi)를 eclosion 당일에 수집하여 4일 동안 숙성시킨 후 섬 분석을 수행하는 데 사용했습니다. RNAi, 대조군 균주 및 Actin-gal4 드라이버는 상용 소스에서 얻었습니다(재료 표 참조).
2. 관심 연령에 섬 분석에서 수집된 파리를 테스트하기 전에 마취제의 영향을 피하기 위해(CO₂를 사용하는 경우 최소 1일) 파리가 회복되도록 합니다.

4. 실험적 설정

참고: 그림 1B.

1. 목욕 트레이에 소량의 비누를 묻힌 찬물을 넣고 플랫폼을 중앙에 놓습니다.
   참고: 비누는 물의 표면 장력을 감소시킵니다. 물에 닿은 파리는 익사합니다. 이것은 실험 세션이 진행되는 동안 상자 안에서 날아다니는 파리의 양이 증가하는 것을 방지합니다.
2. 투명 상자를 트레이 위에 놓고 램프를 사용하여 위에서 플랫폼을 비춥니다..
   참고: 플랫폼의 조명은 주로 적절한 비디오 대비를 보장하기 위해 필요합니다. 여기에는 일반 12V LED 조명이 적합합니다.
3. 웹캠을 플랫폼 바로 위(상자 외부)에 배치하고 컴퓨터에 연결합니다.
4. 실험 전에 다른 실험 데이터를 저장하기 위해 컴퓨터에 새 폴더를 만듭니다.
   1. 그림 2 A그림 2 A에 설명된 예제의 구조를 따라 폴더를 만듭니다. 예를 들어, 실험 설계에서 각각 5개의 반복실험이 있는 두 개의 유전자형을 테스트해야 하는 경우 먼저 실험 날짜가 포함된 기본 폴더를 만듭니다. 기본 폴더 안에 두 개의 하위 폴더(유전자형당 하나씩)를 만듭니다. 유전자형 폴더 내에 replicate.
      당 하나씩 5개의 새 하위 폴더를 만듭니다. 참고: 추가 분석을 위해서는 개별 실험에 해당하는 이미지 시리즈를 고유한 이름의 폴더에 저장하는 것이 중요합니다.

5. 인터페이스의 "캡처 장치" 섹션에서 비디오 설정 설정

1. 이미지 레코딩 소프트웨어를 열고 "캡처" 탭에서 "타임랩스 이미지..."를 클릭하고 적절한 웹캠을 "캡처 장치"로 선택합니다.
2. 섬에 죽은 파리를 놓습니다. "비디오 설정" 상자를 클릭하여 비디오 설정을 조정합니다. 도구 모음을 스크롤하여 죽은 파리가 흰색 배경에 검은색으로 나타나도록 밝기, 대비 및 색상을 조정합니다(그림 2B). 조정이 완료되면 "확인"을 클릭합니다.

6. 인터페이스의 "타임랩스" 섹션에서 녹화 및 비디오 저장 설정 설정

1. "타임랩스 동영상 설정"에서 설정을 조정하여 실험을 .avi 파일로 저장합니다. "찾아보기..."를 클릭하고 영화가 저장될 디렉토리를 선택하고 비디오 이름을 정의한 다음 "저장"을 누릅니다.
   참고: 비디오 파일은 데이터 정량화에 사용되지 않습니다. 그러나 실험에 대한 전반적인 아이디어를 얻는 것이 유용할 수 있습니다.
2. "타임랩스 동영상 설정" 섹션에서 설정을 조정합니다.
   1. 압축 상자에서 비디오 압축을 위해 "Intel IYUV 코드"를 선택하고 "재생 속도(초당 이미지 수)":"를 10으로 설정하여 "0.1초마다 한 프레임 찍기"를 선택합니다.
   2. "Advanced..."를 클릭하여 실험 시계열을 .bmp 프레임으로 저장합니다. "캡처된 각 프레임에 대한 .bmp 이미지 만들기"를 선택합니다. "찾아보기"를 클릭하십시오. "AVI 동영상 캡처 중" 창에서 동일한 디렉토리를 선택하고(6.1단계에서 선택) "열기"를 클릭한 다음 "확인"을 누릅니다.
      참고: 실험하는 동안 프레임은 .bmp 파일(데이터 분석에 필요)로 저장됩니다. 프로그램은 프레임 이름을 "A"로 지정하고 그 뒤에 프레임 캡처 시퀀스에 해당하는 숫자(예: "A_number.bmp")를 붙입니다(그림 2C). 이전에 기록된 이미지 시리즈를 덮어쓰지 않도록 항상 다른 실험에 속한 이미지를 새 폴더에 저장하십시오. "고급" 상자를 클릭하여 "찾아보기..."에서 이 폴더를 선택하지 않으면 이미지가 비디오 파일과 동일한 폴더에 자동으로 저장되지 않습니다.

7. 섬 분석 및 데이터 수집

1. 이미지 녹화 소프트웨어의 타임랩스 이미지 인터페이스에서 시작 버튼을 눌러 녹화를 시작합니다.
2. 파리가 들어 있는 실험용 바이알을 2-3번 두드려서(3단계) 파리가 바이알 바닥에 있는지 확인합니다. 바이알의 플러그를 빠르게 제거하고 격렬한 움직임으로 모든 파리가 동시에 플랫폼에 떨어지도록 플랫폼의 바이알을 두드립니다(그림 1C).
3. 약 30초 후 "중지" 버튼을 눌러 녹음을 중지합니다.
   참고: 모든 파리가 플랫폼에서 사라지면 녹음을 더 일찍 중지할 수 있습니다.
4. 이미지 녹화를 중지한 후 플랫폼에 30초 동안 남아 있는 파리를 손으로 제거합니다.
5. 다음 실험 녹화를 진행하기 전에 .bmp 파일 및 동영상의 대상 디렉토리를 변경합니다(섹션 6 참조).

결과

그림 1: 섬 분석의 요구 사항, 실험 절차 및 분석을 요약한 순서도. (A) 섬 분석 장비. (B) 섬 분석을 위한 실험 설정. (C) 섬 분석. (D) "Drosophila Island Assay" 매크로를 사용한 섬 분석 데이터 처리. "Drosophila Island Assay" 매크로는 3개의 하위 매크로로 구성됩니다: 1) make stack 및 projection, 2) 플랫폼 정의, 3) 분석. (E) "Island Assay Analysis" 스크립트를 사용한 데이터의 처리 및 통계적 평가.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 x 95mm 초파리 바이알	플라이스터프	재질 보기 32-116SB	-
로지텍 C525 HD 웹캠	로지텍	-	USB 연결이 있는 모든 웹캠이 적합합니다.
웹캠을 잡을 수 있습니다	-	-	-
램프	-	-	12V LED 조명이 적합합니다.
두근 패드	-	-	모든 마우스 패드가 작동합니다.
섬 분석 상자	-	-	크기 : 40x35x2.5cm. 구멍 : 20x30cm. 투명.
섬 분석 목욕	-	-	크기 42x38x25cm. 흰색이 아닙니다.
섬/승강장	-	-	크기 42x38x25cm. 균일 한 흰색.
비누	-	-	표준 식기 세척 세제가 적합합니다.
컴퓨터	-	-	스크립트는 Windows와 Mac 모두에서 실행됩니다.
이미지 레코딩 소프트웨어: HandiAvi®	AZ센던트®	-	HandyAvi는 Windows와만 호환되며 원고 전체에 설명되어 있습니다. http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (버전 5.0)에서 다운로드할 수 있습니다.
이미지 녹화 소프트웨어: WebcamCapture	-	-	이미지 녹음을 위해 HandyAvi 대신 Mac에서 사용할 수 있으며 수 있는 Fiji/ImageJ 플러그인>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ 이 방법을 사용할 때 사용자는 이 원고에 표시된 것과 동일한 폴더 설정 및 이미지 녹화 설정을 사용해야 합니다. 각 실험적 복제에 대해 캡처된 이미지 스택을 해당 실험적 복제 폴더에 Stack.tiff 으로 내보내야 한다는 점을 제외하고.이 데이터에 대해 "Drosophila Island Assay" 매크로를 실행하면 "First frame identifier" 설정에 텍스트가 없어야 합니다.

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