이 프로토콜은 Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌
한 것입니다.
1. 음식 준비
- 재고 유지 및 유충 성장을 위해 분말 효모 3%, 자당 10%, 미리 조리된 옥수수 가루 9%, 한천 0.4%를 포함하는 옥수수 가루 배지를 사용하여 옥수수 가루 배지(CM)라고 합니다.
- 수돗물 100mL에 이스트 30g을 넣고 끓여서 15분간 끓인다.
- 별도로 미리 조리된 옥수수 가루 90g, 설탕 100g, 한천 4g을 수돗물 900mL에 잘 섞습니다.
- 용액을 끓여서 불을 낮추고 계속 저어가며 5분간 조리합니다.
- 5분 후 뜨거운 이스트 용액을 넣고 15분 더 끓입니다.
- 열원을 끄고 용액을 약 60°C로 냉각시킵니다.
- 에탄올에 10% 메틸 4-하이드록시벤조에이트 5mL/L를 넣고 완전히 섞은 다음 10분 동안 그대로 둡니다.
참고: 고농도의 살균제는 유충에게 치명적일 수 있으므로 메틸 4-하이드록시벤조에이트의 양에 주의하십시오.
- 배지를 바이알/병에 분배: 각 플라이 바이알(25mm x 95mm)에 8mL, 각 플라이 바이알(22mm x 63mm)에 3mL, 각 플라이 병(250mL)에 60mL
.
- 바이알을 무명천으로 덮고 보관하기 전에 24시간 동안 실온(RT)에서 건조시킵니다.
- 사용된 한천의 양 및/또는 냉각/건조 시간을 수정하여 실험적으로 올바른 CM의 일관성과 수화를 보정합니다.
참고: 플러그를 뽑고 상자에 포장하고 포장한 바이알은 4°C에서 약 15일 동안 안정적입니다.
- 초파리 성인의 경우 효모 가루 10%, 자당 10%, 한천 2%가 포함된 배지를 사용하여 성인 배지(AM)라고 합니다.
- 분말 효모 10g, 자당 10g, 한천 2g을 증류수 100mL에 섞습니다.
- 이 혼합물을 3분 간격으로 두 번 끓이거나 전자레인지를 사용하여 한천이 녹을 때까지 끓입니다.
- 용액이 60°C로 냉각되면 에탄올에 5mL/L의 10% 메틸 4-하이드록시벤조에이트를 넣고 완전히 혼합한 다음 바이알(바이알당 10mL)에 분배합니다.
- 바이알을 무명천으로 덮고 보관하기 전에 RT에서 24시간 동안 건조시킵니다.
참고: 플러그를 뽑고 상자에 포장하고 포장한 바이알은 4°C에서 약 15일 동안 안정적입니다.
2. 초파리 EDC 투여
- 선택한 EDC를 적절한 용매에 용해시키는 적절한 원액을 준비합니다. EE2(분자량 296.403)의 경우 100% 에탄올 10mL에 1.48g을 용해시켜 0.5M 원액을 만들고 -80°C에서 보관합니다.
주의: EDC는 환경 오염 물질로 간주되며 이를 취급할 때 예방 조치를 취해야 합니다.
- 100mM 용액을 얻기 위해 EE2 원액을 10% 에탄올에 희석하여 물(v/v)을 얻습니다. CM 식품에서 다음 희석 (0.1 mM, 0.5 mM 및 1 mM)을 가장 낮은 농도부터 시작하여 각 처리 그룹에 대해 동일한 최종 농도의 용매를 사용합니다. 대조군 바이알의 경우 동일한 부피의 용매만 사용합니다.
참고: 에탄올의 최종 농도가 플라이 푸드에서 2%를 초과해서는 안 된다는 점을 염두에 두고 용매의 최종 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 좋습니다.
- 선택한 EDC의 적절한 희석액이 포함된 용액을 응고 전에 옥수수 가루 기반 식품에 첨가하고 푸드 프로세서와 완전히 혼합한 다음 바이알에 10mL를 분배하고 면봉으로 덮고 사용하기 전에 상온에서 16시간 동안 건조시킵니다.
참고: 준비 후 즉시 이 매체를 사용하십시오.
- 성체 사육의 경우, 원하는 EE2 농도(0.1mM, 0.5mM 및 1mM)를 얻기 위해 물(v/v) 중 10% 에탄올(v/v)에 서로 다른 작업 EE2 용액(각각 10mM, 50mM 및 100mM)을 준비하고 AM 표면에 각각 100μL를 층을 이룹니다. 대조군의 경우 동일한 부피의 용매만 사용하십시오.
참고: 또는 선택한 EDC의 올바른 희석액이 포함된 용액을 50mL 원뿔형 튜브의 소량의 AM에 넣고 철저히 소용돌이치며 1mL를 AM 바이알 표면에 층화합니다.
- 유리병을 면 거즈로 덮고 부드러운 교반으로 RT에서 12-16시간 동안 건조시킨 후 즉시 사용하십시오.
참고: 건조 과정은 주변 습도에 따라 다르기 때문에 실험적으로 조정해야 합니다.
3. 파리 키우기
- 실험실에서 여러 세대에 걸쳐 유지되는 Oregon R과 같은 강력한 동종 균주를 사용하십시오.
- 가습 된 온도 조절 인큐베이터에 파리를 보관하고 자연 12 시간 광 : CM 식품이 들어있는 바이알에서 25 ° C에서 12 시간의 어두운 광주기로 유지합니다.
- 각 분석에서 RT에서 바이알을 사용합니다.
4. 수명 프로토콜
- 암컷 8마리와 수컷 4마리로 구성된 파리 20바이알을 설정하고 CM(각 10mL)에서 25°C로 보관합니다.
- 4일 후 파리를 버리고 바이알을 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 이 파리는 파리의 다른 연령 동기화 코호트를 얻기 위해 다시 시작하는 데 사용할 수 있습니다.
- 9일차 늦은 오후에 바이알에서 새로 닫힌 파리를 모두 제거하고 바이알을 인큐베이터로 되돌립니다.
참고: 일부 성인은 빠르면 9일째부터 eclose를 시작해야 합니다. 이 파리를 버리면 동기화된 파리의 수를 최대한 모을 수 있어 조기 출현의 부주의한 선택을 피할 수 있습니다.
- 16-24시간 후, 남녀 모두의 성충 파리(생후 1일령)를 3가지 다른 EDC 농도가 보충된 AM 식품과 용매만 함유된 1개가 포함된 250mL 병의 4개 그룹으로 옮깁니다. 필요한 경우 다음 날 다른 배치를 수집하십시오.
- 파리가 짝짓기를 할 수 있도록 2-3일 동안 25°C에서 파리를 유지합니다.
참고: AM 식품 바이알로 옮기는 날은 성인이 된 첫날에 해당합니다.
- 2-3일 후, 각 파리 코호트를 성별에 따라 가벼운 CO2 마취 하에 두 그룹으로 분류합니다. 각 치료당 각 성별에 대해 5개의 병렬 바이알이 3회 반복될 때까지 바이알당 20명의 밀도로 각 성별을 5개의 바이알로 무작위로 세분화합니다.
참고: CO2에 대한 긴 노출 시간으로 인해 장기간 지속될 수 있는 건강 문제를 방지하기 위해 소규모 파리 그룹과 협력하십시오.
- 각 이송에서 생존자 수를 자동으로 얻을 수 있도록 생존한 파리의 수에서 이전 이송까지의 죽은 파리의 수를 빼는 수명 스프레드시트를 준비합니다.
- 3일마다 동시에 해당 음식이 들어 있는 새 바이알로 파리를 옮기고 사망 여부를 확인합니다.
참고: 이식은 마취 없이 이루어져야 하므로 비행 수명에 장기적으로 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
- 옮길 때마다 파리의 나이와 죽은 파리의 수를 기록하십시오.
참고: 살아남은 파리의 수는 스프레드시트에서 자동으로 계산되지만 육안으로 확인하는 것이 좋습니다. 이송 중에 실수로 탈출하거나 죽는 파리는 고려해서는 안 됩니다. 새 바이알로 운반된 죽은 파리가 스프레드시트에 이 메모를 보고하는 것을 두 번 세지 않도록 주의하십시오.
- 모든 파리가 죽을 때까지 4.8 및 4.8.1 단계를 반복합니다.
- 특정 시간에 파리의 생존 확률을 표시하기 위해 각 처리 그룹에 대해 그림 1과 같이 생존 곡선을 만듭니다.
- 각 실험에 대해 100마리의 새로 닫힌 파리를 사용하여 파리의 각 처리 그룹에 대해 세 가지 독립적인 실험을 수행합니다.
- 평균 수명(각 그룹에 대한 모든 파리의 평균 생존 일수), 절반 사망 시간(50% 사망률에 도달하는 데 필요한 기간(일수) 및 최대 수명(90% 사망률에 도달하는 데 필요한 최대 일수)을 보고할 테이블을 준비합니다.
- 대조군에 대한 각 처리 그룹 간의 차이를 백분율로 계산합니다.
- 서로 다른 치료 그룹을 비교하기 위해 통계 분석을 수행합니다.
