초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

이 프로토콜은 Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

1. 이미지 처리 전의 요구 사항

1. 앞서 설명한 바와 같이 세 번째 instar 방황 유충(L3)의 Drosophila 오픈북 준비를 수행합니다.
2. 두 마커의 조합을 사용하는 Co-immunolabel Drosophila NMJ 말단: "Drosophila NMJ Morphometrics"를 사용한 분석을 위한 Dlg-1 또는 Hrp와 Brp, "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"를 사용한 분석을 위한 Brp와 함께 Syt 또는 Csp.
   참고: 동일한 종의 항체는 zenon Alexa Labeling Kit와 같은 항체 접합 키트와 함께 사전 라벨링하여 결합할 수 있습니다.
3. 선택한 현미경(예: 형광(ApoTome 포함 또는 미포함) 또는 컨포칼 현미경 검사)를 사용한 NMJ 말단 이미지.
   1. NMJ 단말기의 2채널 이미지 스택을 획득합니다.
      1. 채널 1이 Dlg-1(또는 Hrp, Syt, Csp)로 면역 표지된 NMJ 말단을 획득하고 채널 2가 Brp로 면역 표지된 NMJ 말단을 획득하는 방식으로 현미경 설정을 조정합니다.
      2. 선택적으로, 매크로를 사용하여 1채널 이미지(단일 항체로 면역 표지된 시냅스)를 분석합니다. 이미지 "Drosophila NMJ Morphometrics"를 사용한 분석을 위해 Dlg-1 또는 Hrp로 고유하게 면역 표지된 NMJ 또는 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"를 사용한 분석을 위한 Syt 또는 Csp.
         참고: 항-Brp만으로 면역염색된 시냅스를 분석하는 것은 불가능합니다.
   2. 얻은 이미지를 개별 .tiff 파일로 내보냅니다. 표시된 대로 획득하지 않은 경우 매크로를 실행하기 전에 채널 순서를 반전합니다.

2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치

1. 웹 사이트 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1 에서 "Drosophila NMJ Morphometrics" 및 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 매크로를 다운로드합니다.
2. 커서를 "Macros update 1" 폴더로 이동하고 나타나는 "view" 옵션을 클릭합니다. 이 폴더의 내용이 포함된 목록이 나타납니다. 이 폴더에는 "Drosophila NMJ Morphometrics" 및 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 매크로가 포함되어 있습니다.
   참고: 두 매크로 모두 동일한 폴더에 제공되는 피지 버전 1.4와 호환됩니다. 매크로는 최신 버전에서 실행되지 않을 수 있습니다. 제공된 버전 1.4를 활용하십시오. 최신 피지 버전을 사용할 수 있는 컴퓨터에서도 이 버전을 시작하는 것은 문제가 되지 않습니다.
3. "모두 다운로드"를 클릭하십시오. 폴더 내용이 .zip 파일로 컴퓨터에 다운로드됩니다. 다운로드한 파일의 압축을 풉니다.
4. Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm 및 Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm 파일을 Fiji.app/plugins/ 디렉토리에 복사합니다. 프로그램을 다시 시작하면 매크로가 플러그인 드롭다운 메뉴 하단에 나타납니다.

3. 하위 매크로 "스택으로 변환"을 실행하여 NMJ 이미지의 z-투영 및 하이퍼스택을 생성합니다.

1. 도구 모음에서 플러그인을 선택하여 그래픽 인터페이스를 시작하고 드롭다운 메뉴에서 "Drosophila NMJ Morphometrics"를 선택합니다.
2. 매크로의 그래픽 인터페이스에서 "고유 파일 문자열" 설정을 정의합니다.
   참고: 현미경 소프트웨어는 스택을 개별 '.tiff 파일로 저장할 때 식별 서명을 사용하여 평면과 채널을 구성합니다. 입력된 고유 파일 문자열 설정은 소프트웨어가 첫 번째 채널의 첫 번째 평면에 할당한 서명을 지정해야 합니다(중요: 가장 낮은 평면 및 채널 번호를 표시해야 함).
3. 하위 매크로 "스택으로 변환"만 선택하고 "확인"을 클릭하고 이미지가 있는 폴더를 선택합니다. 여러 하위 폴더가 있는 기본 디렉터리를 선택하면 고유한 파일 문자열 기준과 일치하는 기본 디렉터리 및 하위 폴더 내의 모든 개별 '.tiff 파일이 처리됩니다.
   1. z-스택에 채널이 하나만 포함된 경우 "채널 1 전용" 상자를 선택합니다.
4. NMJ 이미지당 기본적으로 stack_image_name 및 flatstack_image_name라고 하는 두 개의 새 파일이 나타납니다. 추가 분석을 위해 이러한 스택과 플랫스택만 저장합니다. 이 시점에서 .tiff 파일 시리즈를 삭제하여 필요한 스토리지 용량을 최소화하고 잠재적인 오류 소스를 방지할 수 있습니다.

4. 하위 매크로 "Define ROI"를 실행하여 관심 있는 NMJ 터미널을 설명합니다.

1. "Drosophila NMJ Morphometrics"의 그래픽 인터페이스를 시작합니다.
2. "Define ROI" 확인란만 선택하고 "OK"를 누른 다음 flatstack_name 제목이 지정된 이미지가 저장된 기본 디렉토리를 선택하고 "Select"를 누릅니다. 하위 매크로 "Define ROI"는 선택한 기본 디렉토리 내의 모든 하위 폴더를 자동으로 검색합니다.
3. 첫 번째 투영이 열리면 도구 모음에서 "자유형 선택" 도구를 선택합니다.
4. 마우스를 사용하여 관심 있는 전체 NMJ 터미널이 독점적으로 포함된 선택 항목을 그리고 "터미널 정의" 창에서 "확인"을 클릭합니다. 매크로는 다음 프로젝션을 진행합니다.
5. 다음 ROI를 설명하고 모든 ROI가 정의될 때까지 반복합니다. "roi_image_name"이라는 ROI 이미지 파일은 처리된 각 이미지에 대해 이전에 생성된 스택 및 프로젝션 이미지와 동일한 디렉토리에 저장됩니다. 이 하위 매크로의 출력은 검은색 배경에 흰색으로 표시된 ROI의 이진 이미지입니다.

5. NMJ 터미널 기능을 정량화하기 위해 하위 매크로 "분석" 실행

1. 툴바로 이동하여 "플러그인"을 선택하고 다음을 사용합니다.
   항-Dlg-1 또는 항-Hrp(채널 1)와 항-Brp(채널 2)로 면역표지된 시냅스를 분석할 때 "초파리_NMJ_Morphometrics", 항-Syt 또는 항-Csp(채널 1)와 Brp(채널 2)로 면역표지된 시냅스를 분석할 때 "초파리_NMJ_Bouton_Morphometrics"를 분석할 때.
   1. 하나의 채널 이미지 스택을 분석해야 하는 경우("Drosophila_NMJ_Morphometrics"의 경우 구조 채널 Dlg-1 또는 HRP, "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"의 경우 Syt 또는 Csp) "채널 1 전용" 상자를 선택합니다.
2. 분석할 이미지에 해당하는 스케일을 조정합니다.
   1. 이미지의 한 픽셀이 2.5μm에 해당하는 경우 Scale-Pixels = 1, Scale-Distance(μm) = 2.5를 나타냅니다. 두 설정이 모두 0으로 유지되는 경우 NMJ 영역, 둘레, 길이 및 가장 긴 분기 길이가 픽셀 수로 표시됩니다.
3. 필요한 경우 매크로의 기본 분석 설정을 조정합니다. 하위 매크로 "Analyze"가 이전에 실행되어 결과가 만족스럽지 않은 경우에만 조정을 수행합니다(설정을 최적화하는 방법에 대한 지침은 이 섹션의 끝 부분 및 섹션 6 참조).
4. "분석" 및 "대기" 확인란을 선택하고 "확인"을 누릅니다.
   1. 2채널 이미지에서 하위 매크로 "Analyze"를 실행할 때 "Wait" 확인란을 선택합니다. 그렇지 않으면 제한된 컴퓨터 용량으로 인해 활성 영역 계산 오류가 발생할 수 있습니다.
5. 새 창 "Choose a Directory"가 열리면 이미지가 있는 디렉토리를 선택하고 "선택"을 누릅니다. 매크로는 기본 디렉토리 및 해당되는 경우 후속 폴더에 저장된 모든 이미지를 분석합니다 (이전 하위 매크로 실행의 세 가지 파일 인 stack_image_name, flatstack_image_name 및 roi_image_name 사용). 매크로는 각 이미지를 개별적으로 그리고 연속적으로 처리합니다. 이 작업은 컴퓨터 용량에 따라 이미지 스택당 몇 분이 걸릴 수 있습니다.
6. 매크로를 실행한 후 저장된 분석된 각 시냅스에 대해 res_image_name라는 새 이미지 파일이 부모 폴더에 생성됩니다. 정량적 측정은 "results.txt" 파일로 저장됩니다.
7. 모든 결과 이미지를 검사하여 세분화 오류가 있는 사진을 감지하고 제외합니다. 가능한 세분화 오류는 표 1에 설명되어 있으며, 이러한 오류를 우회하기 위해 설정을 조정하는 방법에 대한 조언이 함께 제공됩니다. 이러한 세분화 오류가 있는 결과 이미지는 그림 1.
   참고: 사용자 인터페이스에서 관찰된 기본 설정으로 매크로를 실행할 때 매크로 평가를 수동 평가와 비교할 때 약 95%의 정확도가 있었습니다.

6. 이미지에 대한 매크로 설정 조정

1. 이미지의 5% 이상이 세분화 오류를 표시하는 경우 다양한 알고리즘을 탐색하여 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 정의/선택합니다.
2. 롤링 볼 반경 값 조정
   참고: rolling ball radius 함수는 이미지의 배경을 뺍니다. 이 기능은 형광 현미경에서 획득한 이미지로 작업하거나 이미지에 높은 배경 노이즈가 있을 때 매우 중요합니다. 배경을 빼면 매크로의 자동 임계값 단계가 NMJ 말단의 적절한 분할을 생성하는 데 도움이 됩니다.
   1. 하위 매크로 "Convert to stack"에 의해 생성된 3개의 NMJ stack_image_name 이미지를 선택합니다. 이미지 데이터 세트를 대표하는 이미지를 선택합니다.
   2. 도구 모음에서 Image(이미지) | 색상 | 채널을 분할합니다. 두 개의 이미지 스택이 생성되며, 하나는 각각 채널 1을 나타내고 다른 하나는 채널 2를 나타내고 저장합니다.
   3. Dlg-1, Hrp, Syt 또는 Csp immunolabeling에 해당하는 채널 1 open에 속하는 이미지 스택을 엽니다.
   4. 도구 모음에서 "Process"를 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 "Subtract Background..."를 선택하여 "배경 빼기" 필터를 실행합니다.
   5. 팝업 창에서 미리보기 확인란을 클릭하고 롤링 볼 반경을 이미지에 가장 적합한 값으로 조정합니다. "롤링 볼 반경" 설정은 시냅스와 배경 사이의 대비를 증가시키는 값으로 조정해야 합니다(그림 2A' 참조).
      1. 예를 들어 그림 2를 참조하십시오. 패널 A에서 시냅스의 일부는 배경과 동일한 회색 수준을 보여주는 반면, 그림 2 패널 A'에서 500의 "롤링 볼 반경"은 시냅스와 배경 사이에 강한 대비를 나타냅니다.
   6. 도구 모음에서 를 선택하여 z-투영을 만듭니다. 이미지 | 스택| Z-투영, 투영 유형 = 최대 강도를 선택하고 결과 이미지를 저장합니다. 롤링 볼 반경에 대한 적절한 값이 정의되면 동일한 롤링 볼 반경 값을 가진 나머지 대표 이미지에 대해 "배경 빼기" 알고리즘을 실행합니다. Z 투영을 만들고 (임의의 디렉토리에) 저장합니다 .
      참고: 8비트 또는 RGB 이미지의 롤링 볼 반경 값은 적어도 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 개체의 반경만큼 커야 합니다. 16비트 및 32비트 이미지의 경우 반경은 픽셀 값 범위에 반비례해야 합니다.
3. 사용할 다양한 자동 임계값을 결정합니다.
   1. 이전 단계(6.2.6)에서 저장한 Z-투영을 열고 이미지를 선택합니다. 조정 | AutoThreshold 명령 | 모두 시도해 보세요.
   2. 이진 임계값 결과 이미지는 모든 다른 자동 임계값 알고리즘과 함께 표시되므로 이미지에 가장 적합한 알고리즘을 결정합니다.
      1. 나중에 매크로를 실행할 때 그에 따라 매크로 설정에서 임계값을 변경하십시오.
      2. NMJ 개요 임계값으로 "RenyiEntrophy" 또는 "Moments"와 같은 더 제한적인 임계값을 사용하고 NMJ 골격을 결정하려면 "Li", 활성 영역을 결정하려면 "Huang"과 같은 더 허용적인 임계값을 사용합니다. 이미지가 배경이 거의 또는 전혀 없이 매우 선명한 경우 "Huang"을 "NMJ 윤곽선 임계값"으로 사용합니다. 그렇지 않으면 이미지 분할 후 시냅스의 일부가 누락될 수 있습니다.
      3. 예를 들어 그림 2B를 참조하십시오. 시냅스의 적절한 분할은 녹색 상자로 강조 표시된 자동 임계값으로 얻어집니다. 적합하지 않은 임계값의 몇 가지 예는 빨간색 상자로 강조 표시됩니다(고배율에서 시냅스 확인). 후자의 경우, 시냅스의 일부가 누락되거나 배경의 일부가 포함됩니다.
4. 작은 입자의 최대 크기를 결정합니다
   참고: 이 기능은 NMJ 윤곽선 임계값 및 스켈레톤 임계값에 의해 감지된 모든 입자 중 "작은 입자 설정"에 정의된 값보다 작은 입자를 분석에서 제외합니다. 이 값은 픽셀 단위로 정의됩니다. 이 기능은 노이즈 필터 역할을 하며 얻은 이미지에 높은 비율의 불균일한 배경(예: 결정/먼지)이 존재할 때 매우 유용합니다.
   1. 6.2.6단계에서 저장한 Z-투영을 열고 Analyze(분석)를 통해 픽셀 수를 감지하도록 스케일을 설정합니다. 배율을 설정합니다. 다음 설정을 적용하십시오 : 픽셀 단위 거리 = 1, 알려진 거리 = 1, 픽셀 종횡비 = 1, 길이 단위 = 픽셀 및 "확인"을 누릅니다. 도구 모음에서 "타원형 선택" 도구를 클릭합니다.
   2. 마우스를 사용하여 면역염색에 존재하지만 NMJ에 속하지 않는 단일 입자를 밀접하게 둘러싼 선택 영역을 그립니다. Windows 사용자의 경우 Ctrl+m, Mac 사용자의 경우 cmd+m을 누릅니다. 결과 창이 열리고, 선택된 파티클의 영역이 픽셀 수로 표시됩니다.
   3. 이미지에 존재하는 여러 아티팩트에 대해 이전 단계를 여러 번 반복하여 가장 큰 오염 입자/아티팩트 영역을 확인합니다. 이것은 나중에 매크로를 실행할 때 설정에서 설정하는 값이 됩니다. 매크로를 실행할 때 "Small Particles Size"를 관찰된 가장 작은 입자 크기로 설정하면 고름이 25%의 여백
   을 갖습니다.
   4. 예를 들어 그림 2D를 참조하십시오. 검출된 가장 큰 결정의 영역은 112픽셀입니다. 매크로로 이 이미지를 처리할 때 "작은 입자 크기" 설정은 125 - 150으로 설정되어야 합니다.
5. 최소 bouton 크기 결정
   참고: 이 함수는 NMJ 개요 임계값에 의해 감지된 모든 바우톤을 분석에서 정의된 값보다 작게 제외합니다. 이 값은 픽셀 단위로 정의됩니다.
   1. 섹션 6.4에 설명된 것과 동일한 단계를 따르되, 이 경우 NMJ 터미널에 있는 가장 작은 부통을 둘러싼 선택 항목을 그립니다. 측정된 것의 가장 작은 부톤에 해당하는 가장 작은 영역을 선택합니다. 이것은 나중에 매크로를 실행할 때 최소 bouton size 설정에서 설정하는 값입니다.
6. "Maxima noise tolerance" 값을 정의합니다.
   1. 매크로에 대한 "Find maxima noise tolerance" 값을 정의하려면 섹션 2.2.2에 저장된 채널 6.2.2 Z-스택을 엽니다.
   2. 팝업 메뉴의 plugins 탭으로 이동하여 Process (프로세스) | 최대(3D)를 선택하고 maximum_image_name이 나타나면(몇 분 정도 걸릴 수 있음) 원본 이미지 스택을 닫습니다.
   3. Maximum..._image_name(새로 얻은 이미지 스택)을 선택하고 Plugins(플러그인) | 프로세스 | 최소값 (3D), 새 이미지 최소값 Maximum..._image_name이 최대값... _image_name 스택을 닫을 때 발생합니다.
   4. 도구 모음에서 Process(프로세스) | 최대 값 찾기.... 새 창 "최대값 찾기..."가 열립니다. "미리보기 포인트 선택..." 확인란을 클릭하고 "노이즈 허용" 상자를 기본 매크로 설정 50으로 채웁니다. 최대 포인트는 이미지에서 작은 십자가로 표시됩니다.
      1. 주석이 달린 활성 영역, 즉 선택한 스택 평면에 초점이 맞춰지지 않은 활성 영역 위에 있지 않은 교차 또는 배경에서 감지된 잘못된 활성 영역을 관찰하는 경우 "노이즈 허용 오차" 값을 높입니다.
         1. 반면에, 불완전하게 주석이 달린 활성 영역을 관찰하는 경우, 즉 초점이 맞춰진 활성 영역이 인식되지 않는 경우 "최대 노이즈 내성" 값을 줄입니다. 십자가가 초점이 맞춰진 활성 영역에 적절하게 레이블을 지정할 때까지 이 절차에 따라 다른 값을 계속 시도하십시오. "Find maxima noise tolerance(최대 노이즈 허용 범위 찾기)"를 이 값으로 채웁니다.
         2. 예를 들어 그림 2C를 참조하십시오. 너무 많은 활성 영역이 감지되었습니다. 그림 2C'에서는 "Maxima noise tolerance" 값을 증가시킬 때 초점이 맞춰진 활성 영역만 감지됩니다.
   5. 이전 모든 단계에서 정의한 설정을 사용하여 5.1단계에서 선택한 대표 이미지에 대해 하위 매크로 "Analyze"를 실행합니다.
7. Brp-puncta 하한 및 상한 임계값 조정
   1. 6.6단계에 따라 매크로를 실행한 후 2_active_zone_stack_image_name라는 새 파일이 나타납니다. 이 이미지 스택에서 "최대값 찾기" 기능으로 감지된 활성 영역은 각 평면에서 흰색 점으로 표시됩니다.
   2. 이 파일을 도구 모음으로 끌어다 놓아 열고 Image(이미지) | 스택 | Z-프로젝트 | 프로젝션 유형 = 슬라이스 합계. 2_active_zone_stack_image_name의 투영이 얻어집니다.
   3. 이미지 | 조정 | 문지방. 새 창 "임계값"이 열립니다. 위쪽 막대를 밀어 원하는 모든 초점/Brp 양성 지점이 빨간색으로 시각화되는 임계값을 선택합니다.
      참고: 임계값을 너무 낮게 설정하면 과도한 활성 영역이 계산됩니다. 너무 높게 설정하면 활성 영역의 일부가 누락됩니다.
      1. 예를 들어 그림 2E를 참조하십시오. 임계값이 400으로 설정되면 대부분의 활성 영역(1픽셀 초점으로 기호화됨)은 빨간색으로 강조 표시되지 않기 때문에 분할에 포함되지 않습니다(그림 2E). 임계값이 값 50으로 설정되면 모든 활성 영역이 빨간색으로 강조 표시됩니다(그림 2, E').
   4. 이 값을 최소 임계값으로 정의합니다. 최대값에 "Upper puncta threshold"를 그대로 둡니다.
   5. 이 섹션의 모든 이전 단계에서 정의한 설정으로 대표 이미지에 대해 하위 매크로 "Analyze"를 다시 실행합니다. 결과 이미지 파일을 비판적으로 평가하고 세분화가 제대로 수행되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 세분화 오류의 특성에 따라 설정을 다시 조정하십시오(그림 1, 표 1).

그림 1: 부적절한 매크로 세분화 결과의 예. "Drosophila NMJ Morphometrics" 또는 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"를 실행한 후의 결과 이미지. 시냅스 말단의 일부는 노란색 윤곽선(A)에 포함되지 않습니다. 배경의 일부는 노란색 윤곽선(B)에 의해 시냅스 말단에 포함됩니다. 파란색 골격선은 시냅스 말단(C - D)을 넘어 뻗어 있습니다. 너무 많은 활성 영역이 감지되었습니다(E - E'). 일부 활성 영역은 분석에 의해 탐지되지 않은 상태로 유지됩니다(G - G'). 활성 영역은 시냅스(F) 외부에서 감지됩니다. 잘못된 부톤 세분화(Drosophila NMJ Bouton Morphometrics를 실행할 때만 해당), 부톤이 누락되거나(H) 분할에 의해 너무 많은 부톤이 감지됩니다(I). 배경의 일부인 결정 또는 먼지와 같은 입자는 분할(J)에 포함됩니다. 이러한 오류를 방지하기 위해 설정을 변경하는 방법은 표 1에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 매크로 설정 조정의 예와 이미지 분할에 대한 결과. (A) "롤링 볼 반경"이 20(A) 또는 500(A')으로 설정된 경우 ApoTome을 사용하여 형광 현미경에서 이미지화된 Dlg-1 면역 표지 시냅스의 배경 미리보기를 뺍니다. (B) 이미지 | 조정 | Auto-Threshold [자동 임계값] | Try all 이미지는 16개의 서로 다른 자동 임계값 알고리즘으로 얻은 이미지 분할을 보여줍니다. (C) "노이즈 허용 오차"를 50 (C) 및 500 (C')로 설정할 때 "최대값 찾기" 미리보기; 세분화에 의해 감지된 활성 영역은 작은 십자 표시로 레이블이 지정됩니다. (D) 컨포칼 현미경으로 이미징된 anti-Hrp로 표시된 시냅스 면역 표지의 이미지 배경에 나타나는 "작은 입자"의 측정. (E) 2_active_zone_stack_ima-ge_name에서 얻은 "합계 슬라이스" 투영. 임계값은 400(E) 및 50(E')으로 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 매크로에 의해 생성될 수 있는 이미지 분할의 다양한 종류의 오류에 대한 문제 해결 가이드. 이 표에서는 매크로에서 생성되는 다양한 종류의 이미지 분할 오류에 대해 설명합니다. 이는 결과 이미지에서 쉽게 감지할 수 있습니다. 각 오류 유형의 예는 그림 1에 나와 있습니다. 표의 "조정 섹션"에서 조정해야 하는 설정이 강조 표시되고 사용자는 이러한 설정을 조정하는 방법을 설명하는 섹션 6의 중요한 하위 단계로 참조됩니다.