Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observation Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila larvae (이광자 레이저 유도 신경 손상: 초파리 유충에서 축삭돌기 퇴행 및 재생을 관찰하는 방법)

초록

출처: Li, D., et al. 말초 및 중추 신경계의 신경 재생을 연구하기 위한 초파리 생체 내 손상 모델. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 Drosophila melanogaster 유충에서 축삭의 이광자 레이저 절제와 부상을 유도하고 부상 부위를 이미지화하는 예제 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌

한 것입니다.

1. 이광자 손상 및 공초점 이미징

1. 현미경 설정
   참고: 이 실험에는 이광자 레이저가 있는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경이 사용되었지만, 동일한 설정의 다른 시스템도 충분합니다. 2광자 레이저(930nm)는 부상 전달에 사용되었으며 아르곤 레이저(488nm)는 GFP의 공초점 이미징에 사용되었습니다.
   1. 각 세션을 시작할 때 이광자 레이저 및/또는 컨포칼 레이저와 현미경을 켭니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
   2. 이광자 손상의 경우 930nm(1,950mW)에서 이광자 레이저로 GFP를 이미징하기 위해 다음 매개변수를 설정합니다.
      1. 회선 스캔 모드를 선택합니다. 핀홀을 끝까지 엽니다. 레이저 강도를 ~20%(390mW)로 높입니다.
      2. 프레임 스캔으로 512 x 512를 선택합니다. 최대 스캔 속도를 사용합니다(일반적으로 픽셀 체류 시간이 0.77μs인 경우). 평균 숫자가 1이고 비트 깊이가 8비트인지 확인합니다.
      3. 게인을 ~750으로 설정하고 오프셋을 0으로 설정합니다.
      4. 이 사전 설정된 실험 프로토콜을 2P GFP 930 Ablation으로 저장하면 향후 실험에서 쉽게 재사용할 수 있습니다.
   3. 컨포칼 이미징의 경우 488nm에서 아르곤 레이저로 GFP를 이미징하기 위해 다음 매개변수를 설정합니다.
      1. 획득 탭을 선택한 다음 Z-스택을 선택합니다.
      2. "레이저"에서 488nm 아르곤 레이저의 전원을 켭니다.
      3. 채널로 이동하여 488mm 레이저를 선택하고 레이저 출력을 5-10%로 높입니다. 핀홀의 경우 1-2 통풍 단위(AU)를 사용합니다. 게인을 650으로 조정합니다.
      4. 획득 모드에서 프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택하고 최대 스캔 속도, 평균 2 및 8비트의 비트 깊이를 사용합니다.
      5. 이 사전 설정된 실험 프로토콜을 GFP 이미징으로 저장합니다.
2. 디에틸 에테르를 이용한 유충 마취 및 장착
   1. 흄 후드에서 60cm 플라스틱 페트리 접시에 15mm 유리 접시를 놓습니다. 유리 접시 바닥에 티슈 페이퍼 조각을 접어 놓고 티슈 위에 포도 주스 한천 플레이트를 놓습니다. 유리 접시에 디에틸 에테르를 넣고 티슈 페이퍼가 적시고 접시에 액체 에테르 층이 남아있는 지점까지 추가합니다. 항상 뚜껑을 닫아 두십시오.
   2. 중앙에 할로카본 27 오일 한 방울을 떨어뜨린 유리 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드의 네 모서리에 진공 그리스 4점을 추가하여 나중에 커버슬립을 지지합니다.
   3. 집게를 사용하여 청소한 유충을 집어 60mm 유리 접시의 한천 플레이트에 놓습니다. 유리 접시를 뚜껑으로 덮고 유충이 움직임을 멈출 때까지 기다립니다. PNS 부상/영상 촬영을 위해 꼬리가 경련을 멈추는 즉시 유충을 제거하십시오. CNS의 경우 전체 유충, 특히 머리 부분이 움직이지 않을 때까지 기다립니다.
      참고: 에테르 노출 시기는 매우 중요합니다. 토론을 참조하십시오.
   4. 마취된 유충을 조심스럽게 집어 슬라이드의 할로겐 오일 방울에 머리를 똑바로 세웁니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 추가합니다. 유충에 닿을 때까지 커버슬립을 부드럽게 눌러 아래로 누릅니다(그림 1A).
   5. 커버슬립을 왼쪽이나 오른쪽으로 부드럽게 밀어 유충을 굴려 유충의 위치를 조정하여 관심 있는 뉴런/축삭돌기/수상돌기가 상단에 있고 현미경 렌즈에 가장 가깝도록 합니다.
   6. PNS 부상의 경우 유충의 등쪽을 위로 하여 양쪽 기관이 보이도록 합니다. 그런 다음 유충을 왼쪽으로 ~30도 굴려 클래스 III da 뉴런 축삭돌기(그림 1B 및 1C)를 손상시키고, 클래스 IV da 뉴런 축삭돌기를 손상시키기 위해 90도(그림 1B 및 1E), 또는 클래스 IV da 뉴런 수상돌기(그림 2 A)를 손상시키기 위해 ~30도를 굴립니다.
   7. CNS 손상의 경우 유충이 완전히 복부 쪽이 위로 향하도록(그림 3A) 관심 영역이 z-평면의 현미경 렌즈에 가장 가깝도록 배치합니다.
3. 이광자 레이저에 의한 부상
   1. 유충이 있는 슬라이드를 현미경 아래에 놓고 스테이지의 슬라이드 홀더로 제자리에 고정합니다. 10X(0.3 NA) 대물렌즈를 사용하여 유충을 찾습니다.
   2. 커버슬립에 대물렌즈 오일 1방울을 넣고 40X(1.3NA) 대물렌즈로 전환한 다음 초점을 조정합니다.
   3. 스캔 모드로 전환하고 실험용 프로토콜 2P GFP 930 Ablation을 재사용합니다. 핀홀이 완전히 열려 있는지 확인하십시오.
      참고: 구성은 개별 시스템에 따라 최적화해야 합니다.
   4. 라이브 모드를 시작하여 관심 영역(ROI)을 찾고 적절한 확대/축소로 좋은 이미지 품질을 얻을 수 있도록 설정을 미세 조정합니다.
      참고: 이 단계의 목적은 최고 품질의 이미지를 촬영하는 것이 아니라 손상시킬 뉴런/축삭돌기/수상돌기를 찾는 것입니다. 따라서 과다 노출 또는 광표백을 방지하기 위해 대상 영역을 시각화하기에 충분한 최소 설정을 사용하십시오.
   5. Live scan을 중지하여 Crop 버튼을 사용할 수 있게 합니다. 스틸 이미지를 로드맵 역할을 하도록 하십시오. 자르기 기능을 선택하고 스캔 창을 조정하여 다칠 대상에 초점을 맞춥니다.
   6. ROI를 예상 부상 부위의 크기로 줄입니다. 예를 들어, 축삭돌기나 수상돌이의 너비를 덮기만 하면 부상의 정밀도를 보장하고 주변 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 원하는 경우 자르기 전에 ROI를 확대하여 보다 정확한 부상을 입을 수 있습니다.
   7. 새 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도를 줄이고 레이저 강도를 높입니다. 라이브 모드에서 스캔된 조직 형광 신호를 기반으로 레이저 강도의 증가를 결정합니다.
   8. 일반적으로 이광자 레이저 강도를 PNS 손상의 경우 25%, VNC 손상의 경우 50-100%부터 설정합니다. PNS 축삭 손상의 경우 레이저 강도가 ~480mW이고 픽셀 체류 시간이 8.19μs인지 확인합니다. VNC 축삭 손상의 경우 레이저 강도와 픽셀 체류 시간이 일반적으로 각각 965-1930mW 및 8.19-32.77μs인지 확인하십시오.
   9. 연속 스캔을 시작합니다. 커서를 계속 Continuously 버튼 위에 올려 놓습니다. 이미지를 면밀히 주시하고 형광의 급격한 증가가 관찰되는 즉시 스캔을 중지하십시오.
      참고: 형광 스파이크의 출현은 부상 부위의 자동 형광 때문입니다.
   10. 설정을 재사용하여 라이브 모드로 다시 전환합니다. 초점을 조정하여 방금 대상으로 지정된 관심 영역을 찾습니다.
       참고: 성공적인 부상의 좋은 징후는 부상 부위에 작은 분화구, 고리 모양의 구조물 또는 국부적인 파편이 나타나는 것입니다.
   11. 다음 뉴런으로 이동하고 1.3.5단계부터 반복하여 단일 동물에서 여러 뉴런을 손상시킵니다. 또는 초기 부상이 충분하지 않은 경우 점차적으로 전력을 높이거나 스캔 속도를 줄이면서 1.3.5단계를 반복합니다.
       참고: 레이저 출력이 너무 높은 경우 부상 후 라이브 스캔 이미지에서 큰 손상 영역을 볼 수 있습니다. 너무 많은 부상은 유충의 죽음을 유발할 수 있습니다.
   12. 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 부상당한 유충을 효모 페이스트가 있는 새 플레이트에 옮겨 유충을 회복합니다. 집게로 한천 판에 여러 동굴을 파십시오. 또는 접시 전체를 사용하는 대신 접시에 한천 섬을 만들어 유충이 접시 밖으로 기어 나올 가능성을 줄입니다.
   13. 60mm 페트리 접시에 물티슈(0.5% 프로피온산 용액에 담근 것)와 함께 플레이트를 넣고 실온 또는 25°C에서 배양합니다.
       참고: 유충은 25°C에 비해 실온(22°C)에서 약 하루 더 유충 단계에 머무릅니다.
4. 부상 후 컨포칼 이미징
   1. 1.2단계와 동일한 마취 및 장착 절차를 사용하여 유충을 준비한 다음 컨포칼 레이저로 이미징하여 원하는 시점에 부상당한 유충을 이미지화합니다.
      참고: 손상 후 24시간(AI)에 유충을 이미지화하여 축삭 손상을 확인하고 48시간 AI(클래스 IV da 뉴런) 또는 72h AI(클래스 III da 뉴런)에서 유충을 이미지화하여 재생을 평가합니다.
   2. 10X 대물렌즈를 사용하여 유충을 찾은 다음 25X(0.8 NA) 대물렌즈로 전환합니다. 실험 프로토콜인 GFP Imaging을 재사용할 수 있습니다.
   3. 라이브 버튼을 클릭하고 이전에 손상된 것과 동일한 뉴런을 찾습니다.
   4. 라이브 스캔 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정합니다. 중지를 누르고 실험 시작을 클릭하여 Z 스택 이미지를 획득합니다.
      참고: 재생을 정량화할 수 있도록 이미지를 캡처할 때 정규화 지점(축삭 수렴점)이 포함되어 있는지 확인하십시오(그림 1D, 1F) – 이에 대해서는 데이터 분석 섹션에서 자세히 설명합니다.
   5. 이미지 처리로 전환하고, 방금 촬영한 이미지를 선택하고, 최대 강도 프로젝션을 생성합니다. z-stack 및 maximum intensity 투영 이미지를 모두 저장합니다.

결과

그림 1: 주변부의 Da 뉴런 축삭 재생은 클래스 특이성을 나타냅니다. (A와 B) 유충의 위치를 보여주는 개략도. (C) 클래스 III da 뉴런의 개략도. (D) 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+로 표지된 III급 da 뉴런 ddaF의 축삭돌기는 재성장하지 못합니다. (E) 클래스 IV da 뉴런의 개략도. (F) ppk-CD4-tdGFP/+로 표지된 class IV da neurons v'ada의 축삭돌기는 병변 부위 너머로 재성장합니다. (D와 F) 빨간색 선은 축삭돌기의 길이를 나타내고, 녹색 점선은 세포체와 축삭 수렴점(DCAC)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
디 에틸 에테르, ACS 시약, 무수	아크로스 오가닉스	AC615080010
할로카본 27 오일	제네시 사이언티픽	59-133
프로피온산	J.T.베이커	U33007
커버 안경 : 직사각형	피셔 사이언티픽	12-544-D	50mm X 22mm
Zeiss LSM 880 레이저 스캐닝 현미경	자이스
Zen 소프트웨어	자이스
카멜레온 울트라 II	간섭성의

명 조