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이 프로토콜은 Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌했습니다.
1. 라이브 셀 이미징을 위한 MB 설계
- mfold server의 "RNA form"(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)을 사용하여 mRNA target의 2차 구조를 예측하기 위해 target RNA sequence를 접습니다.
- 대상 염기서열을 FASTA 형식으로 붙여넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적성(각각 MFE 값의 5 또는 10% 이내의 자유 굴곡 에너지를 가진 구조)을 선택하고, 그에 따라 계산된 최대 접기 수를 조정합니다(예: 10% 하위 최적성의 경우 더 큼).
참고: MB를 설계할 때 차선의 2차 구조를 포함하면 최소 자유 에너지(MFE) 구조만 있을 때 예측된 것보다 더 유연하거나 더 단단할 수 있는 표적 mRNA 내 영역을 식별할 수 있으며, 이는 라이브 셀 이미징에 적합한 MB의 전반적인 설계를 개선합니다.
- 800 nucleotides (nt)의 mRNA target에 대해 "immediate job"을 선택하거나 801에서 8,000 nt 사이의 mRNA length에 대해 "batch job"을 선택합니다. "ss-count" 파일을 간단한 텍스트 파일로 저장합니다.
- 1.1단계에서 얻은 "ss-count" 파일을 원하는 매개변수와 함께 PinMol 프로그램(https://bratulab.wordpress.com/software/)에 대한 입력으로 사용하여 mRNA 타겟에 대한 여러 MB를 설계합니다(PinMol 프로그램 사용법을 설명하는 자습서 참조>https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ )을 사용합니다.
- BLAST 분석을 수행하여 선택한 MB의 특이성을 결정합니다: 적절한 데이터베이스와 함께 "blastn"을 사용합니다(예: oskar mRNA 특이적 MB의 경우 "refseq-rna" 데이터베이스 및 Drosophila melanogaster 유기체 사용).
- mRNA 표적의 조직 특이적 발현을 식별합니다(예: oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray 또는 modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) 그리고 모든 긍정적 인 BLAST 히트와 비교하십시오. 관심 조직/세포에서 발현되는 다른 mRNA와 >50% 교차 상동성을 보이는 프로브를 제거합니다.
- 라이브 셀 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있는 현미경 검사 설정에 적합한 형광단 및 소광단 쌍을 선택합니다(예: Cy5/BHQ2).
2. MB 합성, 정제 및 특성화
- 앞서 Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) 또는 상용 공급업체의 서비스에 설명된 대로 사내 합성 및 정제를 사용하여 [5'(Fluorophore)-(C3 또는 C6 linker)-(2'-O-methyl MB sequence)-(Quencher)3']] 라벨링 체계를 사용하여 1-5MB(위 참고 참조)를 합성 및 정제합니다. 역상 HPLC를 사용하여 사내에서 또는 상용 제공업체의 서비스를 사용하여 MB를 정제합니다.
참고: 자동 프로브 합성에 사용되는 포스포라미다이트는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변형이 있어야 합니다. 또한 잠김핵산(LNA)과 2'-O-메틸 변형을 번갈아 가며 키메라를 사용하여 더 짧은 MB와 타겟 mRNA 사이의 하이브리드의 안정성을 높일 수 있습니다.
- in vitro 특성화에 사용하기 위해 표적 RNA 영역의 염기서열과 일치하여 MB의 프로브 영역을 보완하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성합니다(2.3-2.5단계 참조, 위 참고 참조). 타겟 mRNA 염기서열에서 발견되는 바와 같이 DNA 타겟의 각 끝에 4개의 추가 뉴클레오티드를 포함함으로써 DNA-올리고뉴클레오티드 타겟 모방체와 MB의 혼성화를 극대화합니다.
참고: 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 대신 체외에서 합성된 RNA 표적을 사용하여 표적 염기서열을 검출하는 MB의 효율성에 대한 보다 엄격한 특성화를 수행할 수 있습니다.
- MB의 열 변성을 단독으로 수행하고, 용융 온도(Tm)를 측정하고, MB가 생리학적 온도에서 원하는 헤어핀 모양을 가정하는지 확인합니다. 우리는 60에서 90 °C 사이의 Tm 값을 관찰했습니다.
- DNA 올리고뉴클레오티드 타겟이 있는 상태에서 MB의 열 변성을 수행하고 이전에 Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)에 설명된 바와 같이 MB:DNA 타겟 하이브리드의 Tm을 측정합니다. 55 그리고 60 °C 사이 Tm는 MB:DNA 잡종을 위해 원한다.
- 해당 DNA 올리고뉴클레오티드 표적과 체외 혼성화 반응을 수행하고, 이전에 Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)에 기술된 바와 같이 생리학적 온도에서 MB:DNA 하이브리드 형성의 효율성을 측정합니다. DNA 표적 모방을 사용한 빠른 혼성화 동역학이 필요하지만, DNA 표적에 대한 높은 혼성화 효율을 보이지 않는 MB는 in vitro 및/또는 in vivo에서 표적 mRNA에서 더 나은 성능을 발휘할 수 있습니다.
3. 미세 주입을 위한 개별 난실 해부 및 준비
- 갓 부화하고 짝짓기를 한 암컷에게 신선한 효모 페이스트를 2-3일 동안 먹이십시오.
- 마취는 CO2 패드에서 비행하고 미세한 핀셋 (Dumont # 5)을 사용하여 1-2 명의 암컷을 유리 커버 슬립에 할로 카본 오일 700 방울로 옮깁니다.
- 핀셋을 사용하여 실체 현미경 아래에서 등쪽이 위로 향하도록 플라이의 방향을 지정합니다. 뒤쪽 끝을 작게 절개하여 여성의 복부를 절개하고 한 쌍의 난소를 오일에 부드럽게 짜냅니다.
- 새 커버슬립의 오일 방울에 난소를 이식합니다. 한 핀셋으로 한쪽 난소를 부드럽게 잡고 다른 핀셋으로 난소의 가장 어린 단계를 집어냅니다. Oskar mRNA는 난자형성 중간(>7단계)과 그 이후에 활발하게 국소화되며, 어린 난자실(<7단계)은 주입이 더 어렵고 오래 생존하지 못합니다. 개별 난소 또는 난실이 분리되고 수직으로 정렬될 때까지 커버 슬립을 천천히 드래그합니다(아래쪽 이동으로). 또한 난소 난사슬에서 원치 않는 단계를 이동하여 단일 난자 챔버를 분리합니다.
참고: 개별적으로 놀린 계란 챔버가 기름에 뜨지 않고 커버 슬립에 부착되는지 확인하십시오. 이는 성공적인 미세주입과 이미지 획득 모두에 중요합니다.
4. 난실의 간호사 세포에 MB의 미세 주입
- 하나의 분자 비콘(예: osk2216Cy5)을 사용하거나 서로 다른 mRNA를 표적으로 하고 스펙트럼적으로 구별되는 형광단(예: osk2216Cy5 및 drongo1111Cy3)으로 표지된 두 MB를 혼합하여 MB 용액을 준비합니다. HybBuffer (200 mM Tris-HCl-pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 및 100 mM NaCl)에서 각 MB의 농도를 사용합니다. HybBuffer에서 각각 200ng/μL의 동일한 mRNA를 표적으로 하는 동일한 형광단으로 라벨링된 4MB 칵테일의 경우(예: osk82, osk1236, osk2216). 미세주입을 위해 바늘을 로드하기 직전에 MB 용액을 스핀다운합니다.
- 목표를 선택합니다. 적절한 난자 챔버를 찾고 미세 주입을 수행하기 위해 40x 오일 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다.
- 절개된 난자 챔버가 있는 커버슬립을 현미경 스테이지에 장착합니다. 초점을 맞춘 위치에서 대물렌즈를 띄우고 미세주입을 위해 적절하게 배치된 중후반 발달 단계의 난실을 식별합니다(즉, 난모세포 근위부의 간호사 세포 내에서 쉽게 주입할 수 있도록 바늘 끝에 수직인 AàP 축
).
- 바늘(시판용 또는 집에서 준비)에 ~1μL MB 용액(1.1단계 참조)을 넣고 마이크로인젝터에 연결합니다. D. melanogaster 난실에 미세 주입하는 경우, 여러 간호사 세포에 구멍이 뚫리는 것을 방지하기 위해 바늘을 현미경 스테이지에 대해 각도<45°(예: 30°)로 향하게 합니다.
- 주입 압력이 500-1,000hPa이고 보상 압력이 100-250hPa인 인젝터를 설정합니다(재료표 참조).
- 천천히 스테이지를 이동하여 시야를 가져옵니다. 시야: 알 챔버가 없는 기름 방울 영역.
- 마이크로 매니퓰레이터 조이스틱을 사용하여 바늘을 오일 방울로 부드럽게 내리고 끝 부분을 필드 주변으로 초점을 맞춥니다.
- '청소' 기능을 수행하여 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐름이 있는지 확인합니다.
- 바늘을 홈 위치로 가져오고 미세 주입할 난실에 초점을 맞춘 다음 바늘을 다시 초점을 맞추고 난자 챔버 가장자리 근처에 놓습니다.
- 여포 세포와 간호사 세포를 분리하는 막에 초점이 맞춰지도록 대물렌즈의 Z 위치를 미세하게 조정합니다.
- 간호사 셀에 바늘을 삽입하고 2-5 초 동안 주사를 수행합니다.
- 바늘을 부드럽게 제거하고 원래 위치로 집어넣습니다.
- 대물렌즈를 이미지 획득을 위해 원하는 배율(60-63x 또는 100x)로 변경하고 난자 챔버에 초점을 맞춘 다음 획득을 시작합니다.