유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

Abstract

출처: Du, L., et al. 게놈 편집에 의해 초파리에서 조직 특이적 이진 전사 시스템을 생성하기 위한 효율적인 전략. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌한 것입니다.

1. 비행 유전학 및 스크리닝 (그림 1 및 그림 2)

1. 주입된 배아가 성체로 발달하면 각 G₀ 파리를 교차하여 밸런서 파리로 이동합니다. 표적 대립유전자를 포함하는 염색체에 적합한 밸런서를 선택합니다.
2. CO₂ 패드에서 각 G0 교배의 F1 자손을 마취하고 실체 현미경으로 10-20 마리의 수컷을 무작위로 선택합니다. 그림 2.
3. F2 유충이 부화하면 각 교배에서 단일 F1 아버지를 선택하고 단일 파리 게놈 DNA 준비 프로토콜을 사용하여 gDNA를 추출합니다.
   1. gDNA 추출 완충액 준비: 10mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EDTA, 25mM NaCl, 실온에서 보관. 20mg/mL ....

Results

그림 1: 이진 전사 시스템을 생성하기 위한 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집을 위한 워크플로우 개요. 각 단계에 필요한 대략적인 시간이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 게놈 편집 플라이 라인을 확립하기 위한 CRISPR 스크리닝 및 유전자 교차 계획의 그림. 유전자 교배에서 R은 3^번째 염색체에 있는 편.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
트리스 - HCl	시그마 알드리치	T3253	분자생물학
에디타	시그마 알드리치	1161회	분자생물학
염화나트륨	시그마 알드리치	S7653	분자생물학
초순수 DNase/RNase-Free 정제수	써모피셔 사이언티픽	10977-023	분자생물학
뇌관	IDT-DNA		피린지
프로테라제 K	써모피셔 사이언티픽	25530049	분자생물학
2x PCR PreMix, 염료 포함(빨간색)	시들랩	MB067-EQ2R	분자생물학
MKRS/TB6B	Kornberg 연구소		플라이 라인
CO2 스테이션	제네시 사이언티픽	59-122WCU	플라이 푸싱
실체 현미경	올림푸스	SZ-61	플라이 푸싱
마이크로튜브 균질화 유봉	피셔-사이언티픽	TEL:03-421-217	게놈 DNA 분리