$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
이 프로토콜은 Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌한 것입니다.
1. 비행 유전학 및 스크리닝 (그림 1 및 그림 2)
- 주입된 배아가 성체로 발달하면 각 G0 파리를 교차하여 밸런서 파리로 이동합니다. 표적 대립유전자를 포함하는 염색체에 적합한 밸런서를 선택합니다.
- CO2 패드에서 각 G0 교배의 F1 자손을 마취하고 실체 현미경으로 10-20 마리의 수컷을 무작위로 선택합니다. 그림 2.
- F2 유충이 부화하면 각 교배에서 단일 F1 아버지를 선택하고 단일 파리 게놈 DNA 준비 프로토콜을 사용하여 gDNA를 추출합니다.
- gDNA 추출 완충액 준비: 10mM Tris-Cl pH 8.2, 1mM EDTA, 25mM NaCl, 실온에서 보관. 20mg/mL Proteinase K 원액을 준비하여 냉동실에 보관합니다.
- 각 플라이를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 튜브에 라벨을 붙입니다. -80°C 냉동고에 하룻밤 동안 보관하십시오.
- 200μg/mL의 최종 농도의 Proteinase K.
를 함유하는 gDNA 추출 완충액의 새로운 작업 부피를 준비합니다.
참고: 이 단계에서는 이전 버퍼를 사용하지 마십시오.
- 액체를 분주하지 않고 50μL의 찌그러짐 버퍼가 들어 있는 피펫 팁으로 각 플라이를 10-15초 동안 찌그러뜨립니다. 남은 완충액을 튜브에 분배하고 잘 섞습니다. 37 ° C에서 20-30 분 동안 배양하십시오.
- 튜브를 95°C 가열 블록에 1-2분 동안 넣어 Proteinase K를 비활성화합니다.
- 10,000 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 추가 PCR 분석을 위해 제제를 4°C에서 보관하십시오.
- 동일한 방법을 사용하여 음성 대조군 역할을 하는 nos-Cas9 플라이에서 gDNA를 준비합니다. 각 F1 남성의 gDNA를 템플릿으로 사용하여 올바른 "끝남" HDR(그림 1, 그림 3)을 식별하기 위해 3단계 PCR 기반 스크리닝을 수행합니다. 다음 PCR 반응 시스템에서 DNA 전처리 1 μL를 사용하십시오: 염료를 사용한 2x PCR 마스터 믹스 10 μL, 각 프라이머(10 μM) 1 μL, DNA 템플릿 1 μL 및 ddH2O 7 μL.
- 그림 3A, 삽입 보충의 존재를 검사하기 위하여 뇌관 fwd1 및 rev1을 사용하여 PCR를 실행하고; 3' 지구에서 삽입 또는 보충을 확인하기 위하여 fwd2와 rev2 뇌관을 사용하여 PCR를 실행하고; "끝에서" HDR을 검사하기 위하여 뇌관 M13F 및 rev3를 사용하여 PCR을 실행한다(표 1C).
- 확인된 엔드아웃 HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 균형 잡힌 스톡을 구축합니다. 밸런서로 이탈하면 다른 염색체에서 의도하지 않은 돌연변이를 제거하기 위해 다시 날아갑니다.
