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이 프로토콜은 Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).
1. 준비와 고정
- Drosophila melanogaster (초파리)를 준비합니다.
- 100% 이산화탄소를 사용하여 성충 파리를 마취합니다. 마취된 성인(약 10-30마리)을 작은 플라스틱 나사 캡 바이알 또는 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 마취된 파리를 1mL의 고정제(1.25% 글루타르알데히드, 0.1M 인산염 완충액 pH 7.2)에 4°C에서 2시간(또는 밤새) 동안 담급니다. 파리가 고정액의 표면에 떠 있으면 2.5% 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르를 몇 방울 떨어뜨려 고정액의 표면 장력을 약화시켜 조직이 완전히 잠길 수 있도록 합니다. 유리 피펫을 사용하여 고정제를 제거합니다.
2. 세척 및 탈수
- Drosophila melanogaster (초파리)를 씻고 탈수하십시오.
- 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1mL의 0.1M 인산염 완충액 pH 7.2로 10분 동안 고정된 샘플을 3회 세척합니다. 유리 피펫으로 세척할 때마다 제거하고 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
- 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 microfuge 튜브에서 1mL 부피로 10분 동안 샘플을 탈수합니다. 에탄올 농도는 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%입니다. 유리 피펫으로 에탄올을 제거하고 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
- 건조하기 전에 샘플을 덮을 수 있을 만큼의 100% 에탄올과 함께 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 샘플을 보관합니다.
3. 건조
- 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 사용하여 화학 건조를 수행합니다.
- 100% 에탄올 용액을 1:2 HMDS 용액과 100% 에탄올로 20분 동안 교체하고, 1:2 용액을 2:1 HMDS 용액과 100% 에탄올로 20분 동안 교체합니다. 2:1 용액을 100% HMDS로 20분 동안 교체합니다. 한 번 반복합니다.
참고: HMDS는 가연성이며 급성 독소(진피 경로)입니다. HMDS는 장갑, 실험복 및 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 흄 후드에서 처리해야 합니다.
- 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 경우 HMDS의 샘플을 일회용 알루미늄 칭량 접시에 넣습니다. 알루미늄 칭량 접시에 넣은 후 100% HMDS를 샘플을 덮을 수 있을 만큼의 새 100% HMDS로 교체합니다.
- 샘플을 새 건조제(5-6cm 깊이)가 있는 플라스틱 또는 유리 비진공 데시케이터로 옮기고 화학 흄 후드에 넣습니다. 또는 샘플을 화학 흄 후드에 직접 넣고 상자와 같은 헐렁한 뚜껑으로 건조시켜 파편이 샘플에 떨어지는 것을 방지합니다. 샘플을 12-24시간 동안 건조시킵니다.
4. 설치
- Mount Drosophila melanogaster (초파리).
- 알루미늄 마운팅 스텁의 바닥에 레이블을 지정하여 상단에 무엇이 배치되고 있는지 표시합니다.
건조 된 파리를 정밀 핀셋으로 해부 현미경 아래 스텁 상단에 고정 된 접착제 또는 탄소 접착 탭의 원하는 위치에 놓습니다.
- 스텁의 바깥쪽 가장자리 주위에 은 전도성 접착제, 즉 은색 페인트를 바르십시오. 전도성을 보장하기 위해 이쑤시개를 사용하여 은색 페인트를 파리에 연결합니다. 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 하십시오.
- 스텁을 스텁 홀더 상자에 넣고 열려 있는 스텁 홀더 상자를 데시케이터에 넣습니다. 최상의 결과를 위해 은색 페인트를 최소 3시간 또는 밤새 건조시키십시오.