화학적 건조: 주사 전자 현미경(SEM)을 위한 생물학적 시료 준비

초록

출처: Koon, M. A., et al. 주사 전자 현미경(SEM)에서 형태학적 분석을 위한 화학적 건조를 사용한 원핵 및 진핵 생물 유기체의 준비. J. Vis. 특급 (2019).

주사 전자 현미경(SEM)은 주로 생물학적 샘플의 표면 특징을 이미지화하는 강력한 도구입니다. 그러나 적절한 시료 전처리는 고품질 이미지를 얻는 데 매우 중요합니다. 이 비디오는 SEM을 위해 온전한 성인 초파리를 준비하는 탈수 및 건조 단계에 중점을 둡니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).

1. 준비와 고정

1. Drosophila melanogaster (초파리)를 준비합니다.
   1. 100% 이산화탄소를 사용하여 성충 파리를 마취합니다. 마취된 성인(약 10-30마리)을 작은 플라스틱 나사 캡 바이알 또는 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
   2. 마취된 파리를 1mL의 고정제(1.25% 글루타르알데히드, 0.1M 인산염 완충액 pH 7.2)에 4°C에서 2시간(또는 밤새) 동안 담급니다. 파리가 고정액의 표면에 떠 있으면 2.5% 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르를 몇 방울 떨어뜨려 고정액의 표면 장력을 약화시켜 조직이 완전히 잠길 수 있도록 합니다. 유리 피펫을 사용하여 고정제를 제거합니다.

2. 세척 및 탈수

1. Drosophila melanogaster (초파리)를 씻고 탈수하십시오.
   1. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1mL의 0.1M 인산염 완충액 pH 7.2로 10분 동안 고정된 샘플을 3회 세척합니다. 유리 피펫으로 세척할 때마다 제거하고 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
   2. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 microfuge 튜브에서 1mL 부피로 10분 동안 샘플을 탈수합니다. 에탄올 농도는 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%입니다. 유리 피펫으로 에탄올을 제거하고 파리를 제거하지 않도록 주의하십시오.
   3. 건조하기 전에 샘플을 덮을 수 있을 만큼의 100% 에탄올과 함께 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 샘플을 보관합니다.

3. 건조

1. 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 사용하여 화학 건조를 수행합니다.
   1. 100% 에탄올 용액을 1:2 HMDS 용액과 100% 에탄올로 20분 동안 교체하고, 1:2 용액을 2:1 HMDS 용액과 100% 에탄올로 20분 동안 교체합니다. 2:1 용액을 100% HMDS로 20분 동안 교체합니다. 한 번 반복합니다.
      참고: HMDS는 가연성이며 급성 독소(진피 경로)입니다. HMDS는 장갑, 실험복 및 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 흄 후드에서 처리해야 합니다.
   2. 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 경우 HMDS의 샘플을 일회용 알루미늄 칭량 접시에 넣습니다. 알루미늄 칭량 접시에 넣은 후 100% HMDS를 샘플을 덮을 수 있을 만큼의 새 100% HMDS로 교체합니다.
   3. 샘플을 새 건조제(5-6cm 깊이)가 있는 플라스틱 또는 유리 비진공 데시케이터로 옮기고 화학 흄 후드에 넣습니다. 또는 샘플을 화학 흄 후드에 직접 넣고 상자와 같은 헐렁한 뚜껑으로 건조시켜 파편이 샘플에 떨어지는 것을 방지합니다. 샘플을 12-24시간 동안 건조시킵니다.

4. 설치

1. Mount Drosophila melanogaster (초파리).
   1. 알루미늄 마운팅 스텁의 바닥에 레이블을 지정하여 상단에 무엇이 배치되고 있는지 표시합니다.
      건조 된 파리를 정밀 핀셋으로 해부 현미경 아래 스텁 상단에 고정 된 접착제 또는 탄소 접착 탭의 원하는 위치에 놓습니다.
   2. 스텁의 바깥쪽 가장자리 주위에 은 전도성 접착제, 즉 은색 페인트를 바르십시오. 전도성을 보장하기 위해 이쑤시개를 사용하여 은색 페인트를 파리에 연결합니다. 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 하십시오.
   3. 스텁을 스텁 홀더 상자에 넣고 열려 있는 스텁 홀더 상자를 데시케이터에 넣습니다. 최상의 결과를 위해 은색 페인트를 최소 3시간 또는 밤새 건조시키십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
은 도전성 접착제 503	전자 현미경 과학	12686-15
알루미늄 계량 접시	피셔 사이언티픽	08-732-100
알루미늄 실장 스터브(12mm)	전자 현미경 과학	75210
알루미늄 실장 스터브(25mm)	전자 현미경 과학	75186
접착 탭	전자 현미경 과학	76760
전도성 탄소 접착 탭	전자 현미경 과학	77825
폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)	폭스바겐	97062-208 (영어)
히타치 3400N-II SEM	히타치	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	회사는 더 이상 이 모델을 판매하지 않는 것 같습니다

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