파라핀에 성체 초파리 머리 삽입: 조직학을 위한 조직 준비

초록

출처: Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila . J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 연속 절편을 위해 플라이 헤드를 준비하는 기술인 칼라 방법을 사용하여 초파리 머리를 파라핀에 삽입하는 방법을 설명합니다. 파라핀 절편은 뇌의 해부학적 구조에 대한 조직학적 검사와 신경 퇴행의 평가에 사용됩니다. 주요 프로토콜은 한 번의 제처리에서 여러 파리를 처리할 수 있는 방법을 보여 줌으로써 시간 효율성을 높이고 실험 아티팩트를 최소화합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Sunderhaus and Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016)에서 발췌

한 것입니다.

1. 칼라에 머리를 고정하고 파라핀에 삽입하기

참고: 고정 과정의 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 메틸벤조에이트는 건강에 위험을 초래하지는 않지만 매우 뚜렷한 냄새가 있어 흄 후드에서 취급하지 않으면 압도적일 수 있습니다.

1. 파리를 마취하기 전에 99% 에탄올 30mL에 클로로포름 5mL와 빙초산 5mL를 첨가하여 50mL의 Carnoy 용액을 구성합니다(클로로포름과 아세트산을 혼합하지 마십시오). 결정화 접시와 같이 바닥이 평평한 유리 용기에 붓고 칼라가 평평하게 놓일 수 있고 용액으로 완전히 덮일 수 있도록 합니다.
2. CO₂ 또는 에테르로 파리를 마취하십시오.
3. 집게를 사용하여 목으로 파리 (대부분의 칼라로 최대 20 마리)를 칼라에 실을 꿰십시오. 그림 1 A에서 볼 수 있듯이 모든 머리를 같은 방향으로 정렬하고 머리나 눈에 손상이 발생하지 않도록 부드럽게 정렬하는 것을 잊지 마십시오.
4. 섹션에서 파리의 순서를 쉽게 식별할 수 있도록 임의의 위치에 사인 오큘리스 파리(화살표, 그림 1A)를 포함합니다. 또한 실험용 파리의 눈 색깔이 밝거나 흰색인 경우 야생형과 같은 붉은 눈의 파리를 그 사이에 꿰매어 슬라이드를 염색하기에 충분한 색소가 있는지 확인합니다. 하나 이상의 칼라를 사용하는 경우 칼라 번호와 함께 프로토콜 시트에 파리의 순서를 기록하십시오.
5. 칼라가 완성되면 준비된 Carnoy 용액에 3.5-4시간 동안 놓습니다.
6. Carnoy 용액을 적절한 폐기 용기에 버리고 에탄올 세척을 시작합니다. 용기에 칼라를 넣는 것을 방해하지 않도록 천천히 따르십시오.
7. 칼라를 99% 에탄올에 30분 동안 두 번 세탁합니다.
8. 칼라를 100% 에탄올로 1시간 동안 세탁하십시오. 과탈을 방지하기 위해 제 시간에 세척을 교체하십시오.
9. 상온에서 칼라를 메틸벤조에이트 O/N에 넣습니다.메틸벤조에이트의 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 용기를 밀봉합니다.
10. 흄 후드의 적절한 일회용 용기에 메틸베노제이트를 붓습니다. 이전에 준비된 1:1 저융점(56 - 57 °C) 파라핀 왁스와 메틸벤조에이트의 혼합물을 추가합니다. 이 시점부터는 파라핀이 굳지 않도록 65°C의 인큐베이터에 칼라를 보관해야 합니다.
11. 메틸 베노제이트와 파라핀 혼합물을 적절한 일회용 용기에 붓고 65 ° C로 유지 된 용융 된 순수 파라핀 왁스를 칼라에 붓습니다.
12. 30분 후에 파라핀을 교체하고 이것을 최소 5회 반복합니다. 최소 6-8 회 세척을 수행해야합니다.
13. 세탁이 완료되면 칼라를 대략 칼라 크기의 슬롯이 있는 고무 아이스 큐브 트레이에 넣습니다. 완전히 덮일 때까지 용융된 파라핀을 붓고 O/N이 굳어지도록 합니다(기포를 피하십시오).
14. 각얼음 트레이에서 목걸이가 들어 있는 파라핀 블록을 제거합니다. 면도날을 사용하여 칼라에서 파라핀 블록을 분리하고 칼라를 부드럽게 떼어냅니다. 머리는 파라핀 블록에 있고 몸체는 칼라에 남아 있습니다. 블록은 실온에서 보관할 수 있습니다.
15. 칼라를 청소하려면 65°C의 탈파라핀화제에 담가 파라핀을 제거하고 가벼운 문지기로 청소한 후 에탄올로 세척한 후 재사용하십시오.

결과

그림 1: 파라핀 시리얼 섹션. A) 칼라 방법을 사용하여 실험 및 대조 플라이를 하나의 칼라에 끼워 하나의 샘플로 처리할 수 있습니다. 눈이 없는 사인 알파리는 방향(화살표)을 위해 삽입됩니다. B) 칼라에서 플라이 헤드의 방향을 보여주는 개략도. C) 이 이미지에서 다른 플라이 헤드의 섹션은 슬라이드에서 왼쪽에서 오른쪽으로 향하고 있습니다. 슬라이드의 위에서 아래로, 동일한 플라이 헤드의 연속적인 단면을 볼 수 있습니다. 이 경우, 사인 오큘리스 플라이(sine oculis fly)가 위치 3(화살표)에 삽입되었습니다. 단면은 절단 후 단면을 씻어내는 형광 눈 색소에 의해 얼룩집니다. A = 5mm 및 C = 0.5mm의 스케일 바...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
칼라	제네시 사이언티픽	재질 보기 TS 48-100	우리는 Genesee의 것과 같이 레이어 대신 하나의 금속 조각으로 만든 맞춤형 목걸이를 사용하고 있습니다.
임베딩용 고무 아이스 큐브 트레이	가정용품점		크기는 추가 벽에 접착하여 맞출 수 있습니다
결정화 접시	피셔 사이언티픽 컴퍼니	08-762-3
에테르	피셔 사이언티픽 컴퍼니	재질 보기 E138-1
에탄올	Decon 연구소 Inc.	2701
담즙 형성	피셔 사이언티픽 컴퍼니	C298-500
빙하 아세트산	피셔 사이언티픽 컴퍼니	대답 38-212
메틸벤조에이트	피셔 사이언티픽 컴퍼니	M205-500	뚜렷한 냄새 - 흄 후드에 사용하십시오!
낮은 융점 파라핀 왁스	피셔 사이언티픽 컴퍼니	T565	65°C 수조에서 여분의 용융을 유지하십시오

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