성충 초파리 주사: 화합물 또는 라벨 전달 방법

초록

출처: Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. 초파리의 세포 면역 반응 평가, Drosophila melanogaster, 생체 내 식세포 분석 사용. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 살아있는 성충 파리를 주입하는 방법을 설명하며, 표식작용 분석을 위해 표지된 입자와 트리판 블루를 파리 복부에 주입하는 프로토콜의 예시를 포함하고 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Nazario-Toole and Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌한 것입니다.

1. 주입을 위해 플루오레세인 입자 준비

1. 990 μL sterile 1x PBS 및 10 μL 50 mM sodium azide를 첨가하여 fluorescein(재료 표 참조)으로 표지된 시판되는 10 mg의 열 사멸 박테리아 입자를 10 mg/mL의 저장 농도로 재구성합니다. 섞는 소용돌이.
   1. 0.2 mL 튜브에서 일회용 8 μL 분취량으로 나누어 4 °C의 어두운 상자에 보관하여 광 관련 감도를 최소화합니다.
      참고: 아지드화나트륨 방부제는 선택 사항이며 10mg/mL 스톡을 1mL 멸균 1x PBS로 만들고 분주하여 -20°C에서 보관하는 경우 생략할 수 있습니다.
2. 500μL 주사기 여과 녹색 식용 색소와 9.5mL 멸균 1x PBS를 혼합하여 1x PBS에 5% 식용 색소 10mL 용액을 만듭니다.
3. 아지드화나트륨을 제거하기 위해 주입하기 전에 입자를 씻으십시오. 1.7mL 튜브에 42μL 멸균 1x PBS와 8μL의 10mg/mL를 혼합합니다. 실온에서 2.5분 동안 최대 속도로 원심분리기를 사용합니다.
   1. 상층액을 제거하고 50μL 1x PBS를 첨가한 후 실온에서 2.5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다.
   2. 1.3단계와 1.3.1단계를 2회 반복하여 총 3회 세탁합니다.
   3. 최종 세척 후 상등액을 버리고 1x PBS에서 5% 식용 색소 50μL에 입자를 1.6mg/mL로 다시 현탁시킵니다.
   4. 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 4 °C에서 보관하고 1주일 후에 폐기하십시오.

2. 주입 스테이션과 비행을 준비합니다.

1. 주입 패드를 준비합니다. 동시에 최대 4개의 파리 유전자형을 주입하려면 실험실 테이프를 사용하여 직사각형 CO₂ 플라이 패드를 4개의 섹션으로 나눕니다. 현미경 근처의 벤치에서 파리가 패드에 정렬되면 바이알을 배치할 영역을 지정합니다(패드의 각 모서리에 하나씩).
2. 주사를 위해 연령이 일치하는 4-7일 된 파리의 바이알을 준비합니다. 테스트할 각 균주에 대해 수컷 5마리와 암컷 5마리를 준비된 파리 먹이가 담긴 라벨이 붙은 신선한 바이알에 옮기고 25°C를 유지합니다.
3. 기기를 100ms(액체를 배출하기 위한 짧은 가스 압력 버스트 – 나노리터 미만의 부피 전달 가능) TIMED 모드로 설정하여 공압 인젝터(재료 표 참조)를 준비합니다.
4. 현미경 슬라이드를 준비합니다. 1.5인치 길이의 전기 테이프 스트립을 자르고 접착면이 바깥쪽을 향하도록 고리 모양으로 접은 다음 라벨이 붙은 현미경 슬라이드에 놓습니다.

3. 유리 모세관 바늘 준비

1. 바늘 풀러를 사용하여 유리 바늘(얇은 벽 유리 모세관)을 당깁니다.
   1. 현미경 아래에서 마이크로미터로 바늘을 잡고 #5 미세한 점 스테인리스강 핀셋을 사용하여 팁을 부러뜨립니다. 100μm 팁은 상처를 최소화하면서 파리의 표피를 뚫기에 충분합니다.
   2. 각 파리에 주입될 액체의 양을 측정합니다. 바늘에 1x PBS에 멸균 5% 식용 색소를 적재하고 0.01mm 스테이지 마이크로미터에 미네랄 오일 한 방울로 액체를 배출합니다.
      참고: 액체 방울이 구형인 경우 피코리터 단위의 부피는 (크기)³/1910으로 계산됩니다. 직경이 100μm인 바늘은 100ms에 ~2nL를 방출합니다.

4. 파리 주입

1. 1.6 mg/mL 입자 10 μL를 파라필름의 작은 사각형에 피펫팅합니다.
   1. 액체를 바늘로 당겨 인젝터 노즐에 장착합니다(재료 표 참조).
   2. 마취 CO₂로 파리를 정렬하고 복부 쪽이 위로 향하고 머리가 패드 앞쪽을 향하도록 플라이패드의 지정된 영역에 정렬합니다. 벤치의 해당 영역에 바이알을 놓습니다.
   3. 복부 상단 모서리에 있는 파리에게 5, 100ms 펌프의 액체(총 ~10nL)를 주입합니다.
   4. 주입된 파리를 적절한 바이알로 옮기고 바이알의 시간을 기록하십시오. 25 °C에서 유지하십시오.
2. 새 바늘에 0.4% 트리판 블루 용액을 넣습니다.
3. 공압 인젝터를 GATED로 설정하여 일정한 공기 흐름이 바늘에서 액체를 밀어낼 수
있도록 합니다.
4. 파리를 30분 동안 쉬게 한 후 마취하고 복부가 가득 차고 팽창할 때까지 트리판 블루를 주사합니다.
   참고: pH에 민감한 염료로 표지된 입자로 식체 성숙을 검사할 때 파리를 1시간 동안 그대로 두고 파리를 장착하기 전에 트리판 블루를 주입하지 마십시오.
5. 전기 테이프가 있는 현미경 슬라이드에 파리를 장착하고 복부 쪽이 아래를 향하게 합니다. 날개를 플라이 옆으로 밀고 테이프에 고정합니다. 또한 파리가 움직이지 않도록 머리를 테이프에 부드럽게 밀어 넣으십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5430-10 PicoNozzle 키트	세계 정밀 기기	5430-10	1.0mm 피펫용 홀더
E. coli (K-12 Strain) 생물입자, Fluorescein conjugate	인비트로겐	E2861	FITC(Fluorescein)로 표지된 사멸 대장균. 그람 음성 박테리아의 식세포 인식 및 흡수를 테스트하는 데 사용합니다. (~494/~518nm)
니들 피펫 풀러	데이비드 코프 인스트루먼트	모델 725
공압 PicoPump PV820	세계 정밀 기기	SYS-PV820	World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820은 차압을 사용하여 주입 사이에 유리 바늘에 액체를 고정합니다. 사용자는 액체를 배출하기 위해 짧은 가스 압력 버스트를 수동으로 제어하여 나노리터 미만의 부피를 전달할 수 있습니다. 전달되는 액체의 양은 두 가지 주요 변수, 즉 유리 바늘이 열리는 크기와 사출 압력이 적용되는 시간에 따라 달라집니다. 기기를 100ms "TIMED" 모드로 설정합니다.
얇은 벽 유리 모세 혈관	세계 정밀 기기	TW100F-3	주사용 바늘. 외경 = 1.0mm
트리판 블루 솔루션 (0.4%)	시그마	T8154	Fluorescein, Alexa Fluor 또는 Texas Red 표지 입자의 세포 외 형광을 소멸시키는 데 사용됩니다.