Taste Preference Assay: 초파리의 섭식 행동을 측정하는 방법

초록

출처: Bantel, A. P. 및 Tessier, C. R. 성체 초파리에 대한 맛 선호도 분석. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 선호 물질을 섭취한 후 파리의 복부 착색을 평가하여 맛이 다른 착색 용액에 대한 매력 또는 회피를 측정하는 데 사용되는 행동 방법인 미각 선호도 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 다양한 자당 농도의 용액에 대한 파리의 선호도를 측정하는 데 사용되는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Bantel and Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016)에서 발췌

한 것입니다.

1. 굶주림

1. 표준 파리 바이알 바닥에 18.2MΩ의 물로 면봉을 적셔 파리 굶주림 바이알을 준비합니다. 또는 마찬가지로 작은 여과지 스트립을 18.2MΩ의 물로 적셔 바이알 내부에 비스듬히 놓습니다.
2. CO₂ 패드에서 파리를 ~100마리의 동물 세트로 모은 다음 준비된 바이알에 파리를 추가합니다.
   참고: 생후 5일 미만의 동물에서 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 동물의 정확한 나이는 시간이 지남에 따라 맛 선호도의 변화를 결정하기 위한 실험 변수로 제어할 수 있습니다.
3. 면봉이나 거품 마개를 사용하여 바이알을 닫은 상태로 고정합니다. 환경적으로 제어되는 인큐베이터에 바이알을 옆으로 눕힙니다. 온도를 25°C, 습도를 70% 이상으로 유지하십시오. 바이알은 24시간 동안 손대지 않은 상태로 두십시오.

2. 맛 선호도 분석

1. testing과 같은 날에 분석을 위한 모든 tastants를 준비합니다.
   참고: 사용되는 정확한 tastants는 묻는 실험 질문에 따라 다릅니다. 다음은 이 프로토콜에서 사용되는 tastants의 예입니다. 최적화에 대해서는 섹션 4를 참조하십시오.
   1. 10μl의 100mM 자당 용액, 13μl의 적색 식용 색소 및 977μl의 18.2MΩ 물을 결합하여 대조군 타스탄트(1mM 자당)를 준비합니다.
   2. 50 μl의 100 mM 자당 용액, 10 μl의 청색 식용 색소 및 940 μl의 18.2 MΩ 물을 결합하여 실험적 tastant (5 mM 자당)를 준비합니다.
2. 다음과 같은 방식으로 준비된 표준 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 분석 챔버를 만듭니다.
   1. 12시 방향에 플레이트 가장자리에 가장 가까운 10μl 방울 3 개와 6시 방향에 3 방울을 놓습니다. 방울 사이의 간격이 비슷한지 확인하십시오.
   2. 3시 방향에 있는 플레이트 가장자리에 가장 가까운 10μl 방울의 실험적 맛을 3방울 떨어뜨리고 9시 방향에 또 다른 3방울을 떨어뜨립니다. 방울 사이의 간격이 비슷한지 확인하십시오.
   3. 원하는 만큼 반복실험에 대해 2.2.1 및 2.2.2 단계를 반복합니다.
3. 굶주린 파리 ~100마리가 든 바이알 1개를 CO₂ 패드에 비우면 모든 동물을 마취시킬 수 있을 만큼의 시간(약 10초)입니다. 준비된 분석 챔버 중앙에 동물을 솔질하고 접시 뚜껑으로 덮습니다.
   참고: 회수 시간을 개선하고 공급 거동에 대한 간섭을 제한하기 위해 더 긴 기간의 CO₂ 노출을 피해야 합니다. 얼음에 대한 노출(~5분)은 제한된 노출로 인해 발생할 수 있는 CO₂ 행동 영향을 피하기 위해 마취에 사용될 수 있습니다.
4. 분석 챔버를 불투명한 판지 상자에 넣습니다. 상자 외부에 검사 중인 상태와 유전자형을 표시해야 합니다.
5. 전체 설정(2.4단계의 판지 상자에 포함된 분석 챔버)을 25시간 동안 최소 70% 습도의 2°C 인큐베이터에 넣습니다.
6. 모든 반복실험에 대해 2.3-2.5단계를 반복합니다.
7. 2시간 후, 여전히 판지 상자 안에 들어 있는 분석 챔버를 정량 준비가 될 때까지 -20°C 냉동고에 직접 넣습니다.

3. 맛 선호도 분석 정량화

1. 단일 분석 챔버가 실온(약 5분)까지 예열되도록 합니다.
2. 해부 현미경에서 브러시 또는 집게를 사용하여 복부 색상(빨간색, 파란색, 보라색 또는 투명)에 따라 동물을 그룹화합니다(그림 1).
3. 각 그룹에 있는 동물의 수를 기록합니다. 투명한 동물은 분석에 참여하지 않은 것으로 간주되므로 어떠한 계산에도 포함하지 마십시오.
4. 다음 방정식 중 하나에 따라 선호도 지수를 계산합니다.
   1. 관심 있는 실험 맛이 빨간색 염료에 첨가되면 (N_빨간색 + 0.5N_보라색)/(N_빨간색 + N_파란색 + N_보라색)을 사용합니다.
   2. 파란색 염료에 실험적 맛을 첨가하면 방정식을 (N_파란색 + 0.5N_자주색)/(N_파란색 + N_빨간색 + N_자주색)으로 조정합니다.
5. 모든 실험 조건 및 반복실험에 대해 계산을 반복합니다.

4. 맛 선호도 분석 최적화

1. 다음과 같이 식용 색소가 맛 분석의 결과에 영향을 미치지 않도록 사용할 식용 색소 지표의 농도를 경험적으로 결정합니다.
   1. 2.1 단계에서 표시한 것과 동일한 염기 화합물 (예 : 5mM 자당)을 사용하여 4 개의 맛을 준비하되 식용 색소는 생략합니다.
   2. 맛 중 하나에 1.3% 붉은 식용 색소를 첨가하십시오. 각 튜브에 다양한 농도(예: 0.6%, 1%, 1.3%)의 파란색 식용 색소로 나머지 3개의 맛을 만듭니다.
   3. 각 tastant 쌍에 대해 프로토콜 단계 2.2에서 3.4를 완료하십시오: 1.3% 빨간색 대 0.6% 파란색; 1.3% 빨간색 대 1% 파란색 및 1.3% 빨간색 대 1.3% 파란색.
   4. 선호도 지수의 평균 값이 0(그림 2).
      이 될 때까지 파란색 식용 색소의 다른 비율로 4.1.1-4.1.3 단계를 반복합니다 참고: 시작점으로 1.3% 적색 식용 색소와 1% 청색 식용 색소를 결합하면 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 1.3% 염료와 만족스러운 농도의 청색 식용 색소가 일치하지 않으면 다양한 농도의 적색 색소와 일정한 농도의 청색 식용 색소로 4.1.1단계부터 4.1.3단계까지 반복할 수 있습니다.
   5. 동일한 최적화된 식용 색소 농도로 테스트할 모든 조건을 분석합니다.

결과

그림 1: 맛 선호도 분석 결과. 복부 착색의 변형에 대한 몇 가지 예가 표시됩니다. 짙은 빨간색 섭취 (A). 연한 빨간색 섭취(B). 진한 파란색 섭취 (C). 하늘색 섭취 (D). 복부 전체가 자주색으로 나타나거나(E) 복부의 뚜렷한 부위가 빨간색(화살촉)과 파란색(화살표)의 별도 부분(F)을 보일 때 복부를 고려합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
청색 식용 색소 (물, 프로필렌 글리콜, FD & C 청색 1 및 적색 40, 프로필 파라벤)	맥코믹	해당 사항 없음
Cryo/Freezer Boxes w/o 칸막이	어부	TEL:03-395-455
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11251-20
Leica S6 E 스테레오줌 0.63X-4.0X 현미경	W. Nuhsbaum, Inc. (영문)	10446294
페트리 접시 (100mm × 15mm)	BD 팔콘	351029	철저히 세척 및 건조하면 재사용 가능
Quick-Snap 마이크로튜브	알칼리 과학 Inc.	C3017
적색 식용 색소 (물, 프로필렌 글리콜, FD & C Reds 40 및 3, 프로필 파라벤)	맥코믹	해당 사항 없음
자당	IBI 사이언티픽	IB37160