CApillary FEeder (CAFE) 분석: 초파리의 식품 소비 및 선호도를 추적하는 방법

초록

출처: Diegelmann, S., et al. CApillary FEeder Assay는 Drosophila melanogaster의 식품 섭취량을 측정합니다. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 제한되지 않은 초파리의 먹이 섭취와 선호도를 측정하는 행동 방법인 CApillary FEeder 또는 CAFE 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 음식을 전달하고 섭취량을 추적하는 데 사용되는 액체로 채워진 모세혈관에서 증발을 최소화하면서 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌

한 것입니다.

1. CApillary FEeder Assay 조립 및 수행

1. 공복이 필요하지 않은 경우, 탭핑 또는 블로우 파이프를 사용하여 실험용 파리를 분석으로 옮깁니다. 증발을 정량화하기 위해 파리가 없는 3개의 제어 바이알을 포함해야 합니다.
2. 외부 개구부 중 하나를 닫고 있는 피펫 팁(2 - 20 μL 부피)을 조심스럽게 제거하고 채워진 유리 모세관을 하단부터 삽입합니다. 피펫 팁을 모세관 옆에 다시 놓아 모세관을 고정합니다. 여러 식품 용액을 테스트하는 경우 그에 따라 이 절차를 반복하십시오.
3. 식품 공급원이 다른 높이(뚜껑에서 3 - 4cm)에 있는 경우 발생할 수 있는 편향을 피하기 위해 모든 바이알 내부의 모세관 끝을 동일한 높이로 배치하십시오. 실수로 여과지나 식품 공급원의 다른 점도를 만져 모세관이 누출되는 것을 방지하기 위해 여과지와 거리를 유지하십시오.
4. 마커 펜을 사용하여 착색된 액체의 위쪽 끝을 레이블로 지정합니다(_시작 부분 표시). 서로 다른 모세관을 식별할 수 있도록 색상 또는 줄무늬 코드를 사용하여 개별적으로 레이블을 지정합니다.
5. 격자 무늬 인레이가 있는 플라스틱 상자 안에 준비된 여러 CAFE 분석을 놓고 실험 기간(예: 3시간 또는 일) 동안 실험실 조건 또는 온도, 빛 및 습도가 제어되는 기후 챔버(매개변수: 25°C, 60% 상대 습도, 12시간/12시간 명암 주기)에서 상자(그림 2 A)를 안전한 위치로 옮깁니다.
6. 며칠에 걸쳐 분석을 수행하면 하단 여과지가 건조되므로 스폰지 마개(100μL)를 통해 24시간마다 담수를 적용하여 분석 내부의 습도를 일정하게 유지합니다. 30mL ddH₂O로 채워진 4개의 개별 바이알(높이 8cm, 직경 3.3cm)을 습도 장치로 사용하고 플라스틱 상자의 CAFE 어세이 옆에 놓습니다. 실험 중 습도가 제어되는 환경을 조성하기 위해 플라스틱 상자 덮개를 사용하십시오(그림 2A).
   참고: 더 광범위한 변동성은 실험실 조건에서 발생합니다. 그러나 CAFE 분석은 실온(예: 교실에서)에서 수행하는 것이 가능합니다. 증발을 줄이기 위해 가습 장치(젖은 스폰지 마개가 있거나 없는 여과지, 채워진 물병 및 플라스틱 상자 덮개)를 사용하는 것이 좋습니다(그림 2B).
7. 장기 실험을 위해 24시간마다 모세혈관을 새로 채워진 모세혈관으로 교체하십시오. 각 24시간 간격 전에 죽은 파리를 기록하고 살아있는 파리의 수를 사용하여 다음 기간 동안 파리당 소비량을 계산합니다. 반월판의 쇠퇴를 측정한 후 오래된 모세혈관을 버리십시오(2.1 참조).
   참고: 3시간 실험 동안 우리는 죽은 파리를 거의 볼 수 없습니다. 4일 동안 연구하는 동안 우리는 보통 1-3마리의 죽은 파리를 발견합니다.
8. 분석이 끝날 때 또는 모세관을 교체하기 전에 CAFE 분석이 수직 위치에 있는 동안 모세관의 아래쪽 반월판(마크_끝부분)을 마커 펜으로 표시합니다. 마크_끝이 초기 마크(_{마크 시작}) 미만이 아닌 경우 데이터를 폐기합니다. 반월판이 변할 수 있으므로 뚜껑을 제거하지 마십시오.
9. 분석에서 모세관을 조심스럽게 제거하고 데이터 수집을 위해 보관합니다. 파리가 음식에 접근할 수 없으므로 데이터를 버리지 않으면 모세관 내부의 액체가 하단에 도달했는지 확인하십시오. 바이알당 모든 모세혈관을 그룹으로 수집합니다. 절단되지 않은 피펫 팁을 모든 구멍에 삽입하여 파리가 탈출하지 않도록 합니다. 설정을 분해하고 바이알, 뚜껑 및 스폰지 마개를 비누 욕조로 세척하고 나중에 사용할 수 있도록 실온에서 밤새 건조시킵니다.
   참고: 분석 후 파리를 추가로 분석할 수 있습니다. 눈으로 또는 해부 현미경으로 음식 섭취를 확인하십시오.
10. 최소 3일 동안 동일한 유전자형으로 실험을 반복합니다.

2. 데이터 수집 및 분석

1. 캘리퍼스 또는 자를 사용하여 모세관에서 마크_시작과 마크_끝 사이의 거리를 측정합니다. 데이터를 스프레드시트로 직접 전송하려면 USB(Universal Serial Bus) 연결 디지털 캘리퍼(그림 1E)를 사용하십시오. 측정 후 모세관을 폐기하십시오.
2. 모세관 크기를 고려하여 음식물 흡수 또는 증발을 계산합니다. 예를 들어, 길이가 73mm이고 5μL의 식품 용액이 포함된 모세관을 생각해 보십시오. 반월판이 14.6mm 감소한 것은 1μL 용액의 흡수를 반영합니다. 다음 공식을 사용하여 음식 섭취량을 계산합니다.
   음식 섭취량(μL) = 측정 거리(mm)/14.6mm
3. 음식 섭취에 대한 증발의 영향을 제외하려면 파리가 없는 3개(최소한) 제어 바이알의 평균 증발을 계산하십시오. 파리의 음식 소비에 대해 얻은 값에서 이 평균 값을 뺍니다.
4. 다음 공식을 사용하여 플라이당 총 소비량을 계산합니다.
   음식 소비량(μL) = (음식 섭취량[μL] - 증발 손실[μL])/바이알에 있는 총 파리 수. 장기 실험의 경우 24시간 간격이 시작되기 전에 살아 있는 파리의 수를 사용합니다.
5. 수컷과 암컷 파리와 같은 신체 크기의 차이를 설명하려면 음식 섭취량을 체중(μL 음식/mg 파리)으로 정규화합니다.
6. 데이터 분석을 위해 통계 소프트웨어를 사용합니다. 정규 분포 데이터의 경우 스튜던트 T-검정을 사용하여 두 플라이 그룹 간의 차이를 확인하고, 세 개 이상의 그룹에 대해 사후 Tukey Cramer 검정과 함께 ANOVA(분산 분석)를 사용합니다. 선택 상황에서는 비모수 1표본 부호 검정을 사용하여 랜덤 선택과의 차이를 분석합니다.

결과

그림 1: Drosophila melanogaster CApillary FEeder 분석. A) 파리를 이용한 먹이 분석. 축축한 여과지는 바이알 바닥에 물을 공급합니다. 실험 중에 4개의 모세혈관이 제공됩니다(반대쪽 모세혈관에 빨간색과 파란색 음식). 모세관은 두 번째 피펫 팁으로 제자리에 고정되고 사용하지 않는 위치는 피펫 팁을 사용하여 닫힙니다. 뚜껑 중앙에 있는 폼 플러그는 공기를 교환할 수 있습니다. B) 뚜껑의 상세 보기. 절단 피펫 팁(2 - 20 μL, 빨간색 테두리)을 사용하지 않는 위치의 원뿔형 개구부에 삽입하고, 두 번째 피펫 팁을 절단 팁에 삽입하여 구멍을 닫습니다. 절단된 피펫 팁은 미세 모세관의 배치를 제어하는 데 사용되며, 절단되지 않은 팁은 모세관을 단...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바이알(번식)	Greiner 바이오 원	960177	www.greinerbioone.com
바이알(CAFE 분석)	Greiner 바이오 원	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE 분석	작업장	–	–
플라스틱 상자, 낮은 벽	플라스타임	353	www.plastime.it
플라스틱 상자 덮개	작업장	–	–
모 세관	블라우브란트	참조 : 7087 07	www.brand.de
피펫 팁	Greiner 바이오 원	771290	www.greinerbioone.com
여과지 서클	왓맨	10호 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-자당	애플리켐	57-50-1	www.applichem.com
에탄올 앱솔루트	VWR 화학 물질	20,821,330	www.vwr.com
식용 색소(빨간색, E124)	백펀	10027	www.backfun.de
식용 색소(파란색, E133)	백펀	10030	www.backfun.de
비누 용액 (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
디지털 캘리퍼스	개런트	412,616	www.hoffmann-group.com
바이알(번식)			높이 9.8 cm, 지름 4.8 cm
바이알(CAFE 분석)			높이 8cm, 지름 3.3 cm
Lid-CAFE 분석			대학 작업장에서 생성하는, 기술적인 그림 공급하는 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
플라스틱 상자, 낮은 벽			플라스틱 그리드 인레이는 8 x 10 바이알 위치에 맞게 맞춤 제작되었습니다
플라스틱 상자 덮개			크기(37 x 29 x 18cm)
모 세관			DIN ISO 7550 표준, IVD 가이드라인 98/79 EG, 연마 끝
피펫 팁			바깥 쪽 원의 피펫은 뚜껑에 따라 절단됩니다.
여과지 서클			직경 45mm는 사용된 바이알에 맞게 접으면 잘 작동합니다.
D(+)-자당			유해하지 않음
에탄올 앱솔루트			고인화성 액체 및 증기
식용 색소(빨간색, E124)			명시되지 않음
식용 색소(파란색, E133)			명시되지 않음
비누 용액 (CVK 8)			냄새 중성 비누
디지털 캘리퍼스
표준 플라이 푸드			(20L용)
한천			160 그램
맥주 효모			299.33 지
옥수수 가루			1,200 지
당밀			1.6 리터
프로피온산			57.3 밀리리터
니파긴 30%			160 밀리리터

호 명 년 년 명