애벌레 필레 준비: 온전한 감각 뉴런 및 관련 표피 세포를 시각화하는 방법

초록

출처: Tenenbaum, C. M., Gavis, E. R. 감각 뉴런 및 표피 세포의 면역 형광 분석을 위한 유충 필렛에서 초파리 근육 조직 제거. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 감각 수지상 수목화(da) 뉴런 및 관련 표피 세포를 시각화하는 데 사용되는 유충 필렛을 준비하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 세포의 형태를 보존하면서 체벽에서 근육 조직을 제거하는 방법을 자세히 보여주며, 이를 통해 모호한 DA 뉴런과 표피 세포의 면역 염색 및 시각화를 개선합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Tenenbaum and Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2016).

참고: 근육 제거 절차(그림 1)는 이전에 설명한 애벌레 필레 준비 방법을 수정한 것입니다. 근육 제거 전후에 이루어지는 단계를 간략하게 설명하고, 독자는 Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) 및 Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011)에서 자세한 설명을 확인하세요.

1. 차가운 식염수에 유충을 해부한다

1. 저온 HL3.1 식염수 또는 저온 Ca²⁺-free HL3.1 식염수의 작업 희석액을 준비합니다(표 1). 접시 바닥을 덮을 만큼만 차가운 식염수가 있는 실리콘 엘라스토머 접시에 유충을 넣습니다.
   참고: 유충 해부 시 표준 HL3.1 식염수와 Ca²⁺-free HL3.1 식염수를 사용하여 실험해 보는 것이 좋습니다. 칼슘이 없으면 유충 근육 수축이 크게 감소합니다. 따라서 유충 필레는 Ca²⁺-free HL3.1 식염수에서 해부할 때 조작하기가 더 쉬울 수 있습니다. 그러나 근육 수축으로 인해 근육과 표피 사이에 공간이 생기고 이는 표피 손상 위험을 최소화하면서 이러한 조직 사이에 겸자 삽입을 용이하게 할 수 있습니다. 결과적으로, 표준 HL3.1은 표피와 da 뉴런의 무결성을 보존하는 데 선호될 수 있습니다. 우리는 식염수 중 하나로 좋은 결과를 얻고 선택은 사용자에게 맡겨집니다.
2. 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 유충의 복부 표면은 복부 치열 벨트로 식별할 수 있고 등쪽 쪽은 전방에서 후방으로 이어지는 1차 유충 기관 튜브로 식별할 수 있습니다. 유충을 전후 방향으로 늘리고 곤충 핀을 사용하여 머리와 꼬리를 실리콘 엘라스토머 해부 접시에 고정합니다. 미세한 해부 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 한쪽 끝에서 시작하여 다른 쪽 끝으로 자릅니다.
   참고: 이 방향은 일반적으로 연구되는 da 뉴런의 등쪽 클러스터를 보존합니다.
3. 유충을 자른 후 책을 펼치는 것처럼 네 모서리를 해부 접시에 고정합니다. 집게를 사용하여 CNS, 장 및 기관을 포함한 내부 장기를 잡고 제거합니다. 필렛이 팽팽하지만 최대로 늘어나지 않도록 곤충 핀을 조정합니다.
   참고: 근육은 분절 경계에서 체벽에 고정되어 있습니다. 근육은 체벽의 대부분을 덮고 있지만 등쪽 정중선 근처의 좁은 영역에는 없습니다.

2. 근육 제거

1. 근육 조직이 없는 유충의 등쪽 정중선을 찾습니다. 가능한 가장 평평한 방향으로 근육 조직 아래에 삽입할 수 있도록 단일 집게 갈래를 배치합니다.
2. 분절의 앞쪽 경계 근처에 있는 등 정중선에서 시작하여 겸자와 표피 사이의 접촉을 최소화하도록 주의하면서 근육과 표피 사이의 가자갈래를 조심스럽게 밀어 넣습니다.
3. 집게를 위로 당겨 한쪽 앵커 포인트에서 체벽에 대한 근육의 부착을 끊습니다. 관심 있는 나머지 반쪽 세그먼트에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
   참고: 이 프로토콜은 각 da 뉴런 수상돌기 필드의 후방 보존을 최적화합니다. 수상돌기 필드의 앞쪽 부분을 보존하려면 각 세그먼트의 뒤쪽 끝에 겸자 갈래를 삽입하는 것이 가장 좋습니다.
4. 애벌레 필렛이 모든 방향으로 최대한 늘어나도록 곤충 핀을 다시 조정합니다.
5. 차갑고 갓 준비한 4% 포름알데히드를 PBS에 25분 동안 사용하여 해부 접시에 고정되어 있는 동안 필레를 고정합니다.
6. PBS에서 5회 헹굽니다.
7. 집게를 사용하여 표피와의 접촉을 최소화하도록 주의하면서 나머지 앵커 포인트에서 근육 조직을 조심스럽게 떼어냅니다.
8. 해부 접시의 필레를 풀고 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 문헌 [Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011).

결과

그림 1: 근육 제거 절차 개요. 유충을 해부하여 실리콘 엘라스토머 해부 접시에 고정합니다. 근육 조직을 제거하기 위해 근육과 표피 세포층 사이에 분절 경계(2.2) 근처의 등쪽 정중선에서 시작하여 하나의 겸자 갈래를 삽입합니다. 겸자를 위로 당겨 근육과 체벽 사이의 부착을 끊습니다(2.3). 이것은 관심 세그먼트에 대해 반복된 다음 유충은 포름알데히드(2.5)에 고정됩니다. 고정 후 겸자를 사용하여 체벽에서 남은 근육 조직을 분리합니다(2.7 - 2.8) 유충 표피와 표피는 주황색, 클래스 IV da 뉴런은 녹색, 근육은 빨간색으로 표시됩니다. (2.2) 및 (2.7)의 삽입은 단일 유충 반분절의 단면도를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dumont #5 핀셋	전자 현미경 과학	72701-D
마이크로 가위, 8cm, 스트레이트, 5mm 블레이드, 0.1mm 팁	세계적인 정밀 기기	14003
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우코닝	3097358-1004	플레이트 해부용
Austerlitz 곤충 핀, 0.1mm	정밀 과학 도구	26002-10
Fostec 8375 광원	아티산 테크놀로지 그룹	62792-4

조 년 년 년 년