유충 림프선 박리: 초파리 혈구 생산 기관 분리

초록

출처: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. 초파리 유충의 림프선과 혈구를 검사하는 방법. J. Vis. 특급 (2016).

이 동영상은 파리 유충의 주요 조혈 부위인 초파리 림프샘에 대해 설명하고, 면역조직화학 및 형광 이미징을 위해 장기를 해부하고 장착하는 프로토콜의 예시를 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Reimels와 Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016)에서 발췌한 것입니다.

1. 유충 림프선 면역조직화학

참고: 림프선은 유충의 앞쪽 끝에서 약 1/3 길이의 등쪽 뇌 약간 아래에 있습니다. (그림 1B.) 림프선은 등쪽 혈관 측면에 있으며 입 고리 또는 뇌에 부착되어 가장 쉽게 해부됩니다. 야생형, 세 번째 instar 림프선은 매우 작은 구조입니다. 1차 엽의 길이는 약 100 - 200 μm입니다. (그림 2A.)

1. 이 분석에서 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면 암컷이 2-6시간의 고정된 시간 동안 알을 낳을 수 있도록 하여 난자 수집을 제한합니다.
2. 림프선 절제
   1. 각 실험 조건에 대해 1ml 1x PBS(표 1)를 24웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다.
   2. 일회용 이송 피펫을 사용하여 각 웰에 0.1% PBST를 1방울 떨어뜨립니다(표 1
      참고: Tween 20과 같은 세제를 첨가하여 표면 장력을 낮추어 조직이 우물 바닥으로 가라앉을 수 있도록 합니다.
   3. 접시를 얼음 위에 평평하게 놓습니다.
   4. 1x PBS로 채워진 해부 접시 우물에서 유충을 수집합니다.
   5. 조명이 켜진 실체현미경 베이스에 깨끗한 해부 패드를 놓습니다. 일회용 전사 피펫을 사용하여 패드에 0.01% PBST(표 1)의 작은 방울을 떨어뜨립니다. 해부를 위해 유충 한 마리를 PBST 드롭으로 옮깁니다.
   6. 뒤쪽 끝에서 약 1/4 길이, 등쪽이 위로 향하는 한 쌍의 집게로 유충을 잡습니다.
   7. 다른 집게를 사용하여 유충을 잡고 있는 집게 바로 앞쪽의 큐티클을 잡습니다. 입 고리가 드러날 때까지 큐티클을 앞쪽 끝으로 부드럽게 당깁니다.
      참고: 목표는 내부 구조를 방해하지 않고 큐티클을 벗겨내는 것입니다.
   8. 큐티클을 풀고 양쪽 집게를 사용하여 유충을 둘로 자릅니다. PBST drop.
      에서 뒤쪽 끝을 제거합니다. 참고: 큐티클이 입 고리까지 벗겨지지 않으면 유충을 둘로 자르고 뒤쪽 끝을 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 큐티클의 가장자리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 입구를 통해 입 고리를 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 큐티클이 반전되고 입 고리가 노출됩니다. 이것은 대체 해부 방법으로도 사용할 수 있습니다.
   9. 한 쌍의 집게를 사용하여 큐티클(복부 큐티클, 등쪽 큐티클 플랩 또는 둘 다)을 고정하여 안정성을 높입니다.
   10. 다른 집게를 사용하여 노출된 입 고리를 잡고 부드럽게 당겨 빼냅니다.
       참고: 이렇게 하면 큐티클이 내부 구조에서 분리됩니다. 이상적으로는 눈/더듬이 상상 디스크, 뇌, 고리 땀샘 및 등쪽 혈관 옆에 있는 림프선이 입 고리에 부착된 상태로 유지됩니다.
   11. 입 고리를 잡고 타액선, 지방체, 장과 같은 원치 않는 구조를 조심스럽게 제거합니다.
       참고: 뇌가 입 고리에서 분리되더라도 림프선은 여전히 뇌에 붙어 있고 뇌와 함께 수집될 수 있습니다. 이 경우 입 고리 대신 복부 신경삭을 잡으십시오.
   12. 입 고리 또는 복부 신경삭을 손잡이로 사용하여 림프선을 포함하는 절개된 복합체를 얼음 위의 우물로 옮깁니다. 고정하기 30분 전을 초과하지 마십시오.
3. 고정과 면역조직화학(Fixation and immunohistochemistry)
   1. 실체현미경 베이스에 24웰 플레이트를 놓습니다.
   2. p200 피펫을 사용하여 웰에서 PBST를 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 비어 있는 인근 우물은 폐기물을 임시로 쌓는 데 유용합니다.
   3. 웰 측면 아래로 200μl 3.7% 포름알데히드(표 1)를 부드럽게 추가하고 플레이트를 소용돌이쳐 절개된 조직이 완전히 잠기도록 합니다.
   4. 접시를 얼음에 30분 동안 다시 넣습니다. 림프샘이 형광 단백질을 발현하는 경우, 광표백을 방지하기 위해 플레이트를 덮은 상태로 유지하십시오.
   5. p200 피펫을 사용하여 정착액을 조심스럽게 제거합니다.
   6. 웰에 200μl 1x PBS를 첨가하고 실온에서 5분 동안 오비탈 셰이커에 플레이트를 올려 세척합니다. p200 피펫을 사용하여 PBS.
      를 조심스럽게 제거합니다. 참고: 고정된 림프선은 모든 실험 조건에 대한 림프샘이 해부되고 고정될 때까지 PBS의 얼음 위에 남아 있을 수 있습니다.
   7. 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
   8. 웰에 200μl 투과화 용액(표 1)을 추가합니다. RT.
      에서 45분 동안 오비탈 셰이커에 플레이트를 놓습니다. 참고: 45분은 림프선 투과화의 "황금 표준"이지만 저자는 단 20분 후에 성공했습니다.
   9. p200 피펫으로 용액을 제거합니다.
   10. 제공자의 사양에 따라 1차 항체를 항체 용액(표 1)으로 희석합니다. 웰에 300μl의 1차 항체 용액을 추가하고 절개된 조직이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   11. p200 피펫을 사용하여 1차 항체를 제거합니다.
   12. 웰에 200μl 1x PBS를 첨가하고 실온에서 10분 동안 오비탈 셰이커에 플레이트를 올려 세척합니다. p200 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
   13. 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
   14. 공급자의 사양에 따라 항체 용액으로 2차 항체를 희석합니다. 웰에 300μl의 2차 항체 용액을 추가하고 절개된 조직이 완전히 잠겼는지 확인합니다. RT에서 최소 2시간 동안 오비탈 쉐이커에서 배양합니다.
   15. p200 피펫을 사용하여 2차 항체를 제거하고 1.3.12 및 1.3.13단계에 설명된 대로 세척합니다. 최종 세척 후 PBS를 제거하지 마십시오.
4. 림프샘 장착
   1. 70% 에탄올(표 1)과 티슈 물티슈를 사용하여 유리 현미경 슬라이드를 청소합니다.
   2. 각 실험 조건에 대해 유리 슬라이드에 장착 버퍼(표 1) 한 방울(표 1)을 놓습니다.
      참고: 하나의 슬라이드에 두 가지 조건이 맞습니다. 장착 버퍼 부피는 장착할 림프샘의 수에 따라 다릅니다. 약 18 - 20개의 림프선에는 2 μl, 10 - 12개의 림프선에는 1 μl, 5개 이하에는 0.5 μl를 사용합니다.
   3. 조명이 켜진 실체 현미경 베이스에 현미경 슬라이드를 놓습니다.
   4. 한 번에 최대 두 가지 조건의 경우 입 고리 또는 복부 신경삭을 손잡이로 사용하여 집게를 사용하여 웰의 모든 림프샘을 장착 버퍼로 옮깁니다.
   5. 절개된 조직을 원형 또는 직사각형 모양으로 균등하게 배치하고 이 과정에서 장착 버퍼를 분산시킵니다.
   6. 절개된 각 조직에 대해 개별적으로 겸자의 집게 하나를 등쪽 혈관 아래로 밀어 넣고 장착 완충액의 주변을 향해 부드럽게 당깁니다.
      참고: 이렇게 하면 절개된 조직의 나머지 부분에서 림프선을 뽑아내고 유리의 림프선을 평평하게 만들 수 있습니다.
   7. 집게의 집게와 톱질 동작을 사용하여 림프선과 뇌 사이의 등쪽 혈관을 자릅니다.
   8. 절개된 조직의 나머지 부분을 림프선의 반대편, 완충액의 가장 바깥쪽 가장자리로 이동합니다.
      참고: 원치 않게 절개된 조직은 결국 림프선 주위에 둘레를 형성하고 커버슬립이 놓일 지지대 역할을 합니다.
   9. 모든 림프선이 절개된 조직에서 분리될 때까지 반복하여 원치 않는 절개 조직 중 하나를 중앙에 배치하도록 예약합니다.
   10. 두 손가락 사이에 커버슬립을 끼웁니다. 커버슬립에 먼지와 지문이 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 티슈 닦음과 70% 에탄올을 사용하여 커버슬립을 청소합니다.
   11. 커버슬립의 가장자리가 유리 슬라이드의 가장자리와 평행이 되도록 하고 커버슬립을 장착 버퍼 위로 조심스럽게 내립니다.
       참고: 현미경 슬라이드는 이미징 전에 4°C에서 보관할 수 있습니다. 최대 보관 시간은 사용된 항체의 안정성에 따라 다릅니다. 24웰 플레이트는 헹구어 재사용할 수 있습니다.

2. 이미징

1. 제조업체의 사용 설명서에 따라 적절한 표준 형광 또는 컨포칼 현미경에서 20X 이상의 배율로 고정된 혈구와 장착된 림프샘을 이미지화합니다. 제조업체의 사용 설명서에 따라 표준 실체 현미경에서 2X 배율로 전체 유충을 이미지
화합니다.
2. 원하는 경우 디콘볼루션에 대한 소프트웨어 공급자의 지침을 따릅니다.

결과

그림 1: In vivo 결정 세포 멜란화. A) 유충은 가열 전에 PCR 튜브에 개별적으로 배치되었습니다. 빨간색 화살표는 튜브 바닥에 있지 않은 유충을 나타냅니다. B) 가열 후 전형적인 결정 세포 멜란화 패턴으로, 때때로 림프샘(화살표, 등쪽은 표시, 앞쪽은 왼쪽)을 드러냅니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS 정제	MP 바이오메디컬	2810305
해부 접시	코 닝	7220-85
마이크로 원심분리기 튜브	덴빌	C2170
실리콘 해부 패드, Sylgard 184 키트로 제작	Krayden (Fisher를 통해 배포)	NC9644388(Fisher 카탈로그 번호)	제조사 지침에 따라 Sylgard 엘라스토머 키트의 구성 요소를 혼합하여 페트리 접시에서 만들어졌습니다.
실체현미경	Morrell Instruments (니콘 대리점)	MNA42000, MMA36300	니콘 모델 SMZ1000 및 SMZ645
티슈 와이프	폭스바겐	82003-820년
집게	전자 현미경 과학	72700-DZ
P200 피펫	에펜도르프	3120000054
포름알데히드	어부	BP531-500
트리톤	어부	BP151-500
트윈 20	어부	BP337-500
소 혈청 알부민	로키 마운틴 바이오제제	BSA-BSH-01케이
노멀 염소 세럼	시그마	G9023-10ML
노멀 당나귀 세럼	시그마	D9663-10ML
200 프루프 에탄올	폭스바겐	V1001
N-프로필 갈레이트	MP 바이오메디컬	102747
글리세롤	폭스바겐	엠-4750
다피(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)	어부	62248
현미경 커버 유리, 18mm 원형	어부	전화 12-545-100
유리 현미경 슬라이드	어부	Tel.: 22-034-980
24웰 플레이트	코 닝	351147
일회용 이송 피펫	어부	오전 13-711-9시
형광 현미경	자이스		악시오 이미저.Z1

년 시리즈