이 프로토콜은 Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌
한 것입니다.
1. 해부 스테이션 준비
- 실체 현미경과 광섬유 구즈넥이 부착된 광원을 대형 벤치탑에 배치합니다. 안정적인 손 움직임을 촉진하고 해부하는 동안 손 "떨림"을 줄이려면 현미경 주변에 적절한 손 및 팔 받침대 공간을 확보하는 것이 중요합니다. 현미경의 양쪽에 약 8 - 10인치, 현미경 바닥과 벤치 가장자리 사이에 4 - 6인치
의 공간이 있는지 확인합니다.
- 유리 9웰 또는 3웰 접시 2개 또는 3웰에 1.0mL의 PTN 완충액(0.1M 인산나트륨 완충액 pH 7.2, 0.1% 비이온성 계면활성제, 전체 완충액 성분은 재료 표 참조)을 채우고 얼음 위의 해부 스테이션 옆에 놓습니다. 새로 해부된 뇌는 이 접시로 옮겨져 고정 단계까지 보관됩니다.
참고: 실시간 이미징이 필요한 경우 해부 완충액은 1x PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 HL3 완충액이어야 합니다. 세포 내 단백질 국소화가 필요한 경우, PBS를 해부 및 고정을 위한 대체 완충액으로 사용할 수도 있습니다. 고정 후 0.1% 또는 0.3% 비이온성 세제를 함유한 PTN 세척제를 사용하여 세포막의 투과화를 수행해야 합니다.
- PBS를 해부 및 고정에 사용하는 경우, 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하는 동안 플라스틱 피펫 팁에 뇌가 달라붙는 것을 방지하기 위해 세제가 함유된 완충액(예: PTN)으로 피펫 팁을 한 번 이상 헹궈야 합니다.
- 빈 35mm 유리 또는 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 실리콘 엘라스토머가 들어 있는 해부 접시를 구성합니다. 간단히 말해서, 제조업체의 지침에 따라 엘라스토머 구성 요소를 혼합하고 35mm 접시에 붓고 평평한 표면에서 밤새 중합시킵니다. 해부 접시가 포함된 엘라스토머는 집게와 유리 접시와 같은 더 단단한 표면 사이에 접촉이 이루어지면 쉽게 손상될 수 있는 절개 집게의 미세한 끝을 보호하기 위해 사용해야 합니다. 우리는 또한 온라인 소매업체에서 상업적으로 이용 가능한 실리콘 코팅 접시를 정기적으로 구입합니다. 해부 중 대비를 높이기 위해 불활성탄(따라서 검은색)이 포함된 실리콘 엘라스토머 해부 접시가 특히 유용합니다.
2. 성인 뇌 박리 절차
- 마취 3 - 5 일 된 성인 D. melanogaster는 CO2 또는 얼음을 사용하여 마취합니다. 얼음을 사용하는 경우 파리가 들어 있는 바이알을 거꾸로(플러그 끝이 아래로) 얼음 양동이에 ~5분 동안 넣습니다. 바이알을 얼음에 거꾸로 넣으면 파리가 음식에 끼는 것을 방지할 수 있습니다. 파리가 마취되면 얼음 속에 있는 차가운 금속 패드나 페트리 접시 또는 CO2 방출 플라이 패드 위에 파리를 놓습니다. 신경 퇴행을 분석하기 위해 뇌를 해부하는 경우 나이가 많은 파리도 사용할 수 있습니다.
- 전사 피펫 또는 p200 피펫을 사용하여 소량(150 - 200 μL)의 PTN을 해부 접시 중앙에 놓고 PTN의 "기포"를 만듭니다. 실체현미경 아래에 해부 접시를 놓고 PTN의 거품이 시야를 채우고 균일하게 조명되도록 조명과 초점을 조정합니다.
- 파리가 금속 또는 CO2 패드에 누워있는 동안 "배가 위로"(즉, 복부 쪽이 위로) 되도록 파리를 조작합니다.
- 한 쌍의 #5 집게를 사용하여 해부할 파리의 복부를 잡고 파리를 잡고 해부 접시의 PTN에 완전히 담그십시오.
참고: 프로토콜의 나머지 부분에서는 헤드가 PTN에 잠겨 있는 동안 모든 단계를 수행해야 합니다.
- 두 번째 #5 집게를 사용하여 파리 주둥이의 바닥을 잡고 두 쌍의 집게를 분리하여 몸통에서 파리 머리를 분리합니다. 복부와 흉부는 버리십시오. 이 단계에서는 헤드가 해제되지 않고 PTN 표면에 떠 있게 하는 것이 중요합니다. 머리가 떠오르면 뇌를 부수지 않고는 다시 잡기가 매우 어려울 수 있습니다.
참고: 이 방법을 사용하면 뇌와 복부 신경삭 사이의 연결을 끊을 수 있습니다. CNS의 이러한 영역 사이에 온전한 연결이 필요한 경우 대체 해부 프로토콜을 따라야 합니다. 머리가 제거되기 전에 주둥이가 파리 머리에서 분리되면 주둥이가 있던 자리에 구멍이 생깁니다. 이 경우 한쪽 눈 근처의 구멍 가장자리에 있는 플라이 헤드를 잡습니다. 그런 다음 두 쌍의 집게를 서로 잡아당기면서 적당한 힘을 사용하여 머리를 제거합니다. 때때로 머리가 몸에서 제거될 때 장 및/또는 복부 신경삭이 머리에 붙어 있으므로 해부를 계속하기 전에 제거해야 합니다.
- 한 쌍의 집게가 주둥이를 잡는 동안 두 번째 쌍은 오른쪽 파리 눈의 내측 가장자리를 잡아야 합니다. 천천히 겸자를 서로 잡아당깁니다. 이 단계는 소량의 꾸준한 횡력으로 수행해야 합니다. 겸자가 서서히 서로 멀어짐에 따라 주둥이가 머리에서 떨어져 나와 머리 표피에 중앙 구멍을 만들어야 합니다. 두 번째 쌍에서 오른쪽 눈의 내측 부분을 해제하지 않고 첫 번째 쌍의 집게로 주둥이를 버립니다.
참고: 성인 D. melanogaster 뇌는 파리 머리의 꼬리(즉, 후방/후방) 영역에 있습니다. 따라서 머리의 해당 부위를 잡는 것은 피해야 합니다. 이상적으로는 내측 망막 근처의 머리의 앞쪽(즉, 앞쪽) 부분만 겸자로 직접 잡아야 합니다. 이제 뇌 및 관련 기관이 큐티클의 중앙 구멍을 통해 볼 수 있어야 합니다. 이때 구멍에서 튀어나온 기관의 흰색 끈끈한 실은 모두 제거하고 버릴 수 있습니다.
- 두 번째 집게로 왼쪽 망막의 내측 가장자리(머리 큐티클의 중앙 구멍 가장자리)를 잡습니다. 망막과 관련 큐티클을 제거하려면 집게를 180° 각도로 천천히 당겨 떨어뜨립니다. 망막이 아래에 있는 시신경에서 분리됨에 따라 장력이 약간 감소하는 것을 느낄 수 있습니다. 시신경이 찢어지지 않도록 천천히 진행하십시오.
참고: 이 단계에서 겸자를 너무 빨리 분리하면 시신경이 찢어지거나 버섯 몸체 구조가 파괴될 수 있습니다. 때때로 큐티클은 제거되지만 망막 조각은 시신경에 부착된 상태로 남아 있습니다. 버섯체를 촬영하는 경우 전체 망막을 완전히 제거할 필요는 없습니다. 그러나 다른 뇌 영역(예: 시신경 뇌엽의 망막 뉴런 신경 분포)을 분석하려면 다음에 설명된 대로 망막을 완전히 제거해야 할 수 있습니다.
참고: 망막이 뇌의 기저에 있는 시신경에서 서서히 분리됨에 따라, 시신경은 하얗고 끈적끈적한 기관으로 덮인 불투명한 흰색 구조로 관찰될 수 있어야 합니다. 한쪽 망막은 제거되면 폐기할 수 있습니다. 망막 뉴런의 경로 찾기를 분석할 때 이 단계에서 시신경의 손상을 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 광수용체 뉴런의 해부 및 실시간 이미징에 초점을 맞춘 추가 프로토콜도 사용할 수 있습니다.
- 이제 눈에 보이는 기관을 가능한 한 많이 조심스럽게 제거하십시오. 기관은 이미 공기를 포함하고 있거나 나중에 채워질 수 있으며, 이로 인해 뇌가 떠다니게 될 수 있으며, 나중에 면역 염색 단계에서 뇌를 잃을 수 있습니다. 기관을 제거하려면 매우 날카로운 #5 집게를 사용하여 뇌에서 기관을 제거하십시오.
- 왼쪽 파리 망막의 내측 부위를 잡기 위해 두 쌍의 집게를 사용하여 남아 있는 망막과 주변 큐티클을 제거합니다. 조심스럽게 망막을 반으로 찢어 망막과 큐티클 조각을 제거합니다. 어떤 경우에는 뇌를 짓누르지 않고 남아 있는 큐티클을 제거하는 것이 특히 어려운 것으로 판명되었습니다. 이러한 경우, 우리는 복부 신경삭의 나머지 가닥을 한 쌍의 집게로 잡을 수 있고 다른 쌍의 집게를 사용하여 마지막 큐티클을 조심스럽게 제거할 수 있음을 발견했습니다.
- p200 피펫을 사용하여 절개된 뇌를 PTN이 들어 있는 9웰 또는 3웰 접시 중 하나의 웰로 이동합니다. 같은 유전자형을 가진 뇌는 같은 우물에 함께 모여 얼음 위에 보관해야 합니다. 뇌 조직은 절개 후 1시간 이내에 고정해야 합니다. 뇌는 작은 배치로 고정될 수 있으며 더 많은 수의 뇌가 필요한 경우 풀링할 수 있습니다. 대부분의 경우, 경험 많은 연구자는 보통 뇌를 해부하여 약 3-5분 안에 유리 수집 접시에 옮길 수 있습니다.
