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이 프로토콜은 Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp.(2016).
1. 알을 낳는 케이지를 준비합니다
- 물 100ml, 맥주 효모 10g, 포도당 10g, 한천 1g을 전자레인지에 넣어 포도즙 한천 접시를 만듭니다. 3단계에서 1.1번 끓이고 냉동 포도즙 농축액 10g을 첨가하여 한천 플레이트에서 계란의 가시성을 높입니다.
- 한천이 55°C로 냉각되면 20ml를 100mm 페트리 접시에 붓고 굳히십시오.
- 맥주 효모 1g과 물 15g을 섞어 효모 페이스트로 한천 플레이트의 표면을 덮습니다. 효모 페이스트를 한천 플레이트에 붓고 표면이 덮여 있는지 확인한 다음 초과분을 붓고 얇은 효모 잔류 물을 남깁니다. 여러 플레이트를 사용하는 경우 페이스트를 여러 플레이트에 순차적으로 부을 수 있습니다.
- 한천 플레이트를 케이지 바닥으로 옮깁니다.
참고: 32온스 델리 용기는 아크릴 플라이 케이지를 대체할 수 있는 좋은 제품입니다.
- 상단에 구멍을 뚫고 무독성 접착제로 구멍 위에 통기성 메쉬를 붙여서 32oz 델리 용기의 뚜껑을 만듭니다. 접착제가 수용성인 경우 뚜껑에 물이 노출되지 않도록 하십시오.
- 200-300마리의 파리를 용기에 옮기고 뚜껑을 덮습니다. 한천 표면에서 증발하는 것을 방지하기 위해 메쉬로 보호된 구멍을 빈 페트리 접시 뚜껑으로 덮고 원하는 경우 뚜껑 내부에 촉촉한 티슈 페이퍼를 추가합니다. 25 ° C에서 16-20 시간 동안 밤새 파리를 배양하십시오.
2. 알 수집
- 플라스틱 부싱에 나일론 메쉬를 넣어 계란 수집을 위한 체를 준비합니다.
- 계란이 담긴 접시를 회수하려면 빈 용기로 옮겨 케이지에서 파리를 제거하십시오. 다음날 같은 파리를 사용할 경우, 갓 효모를 낸 포도 주스 한천 플레이트가 들어 있는 새 케이지로 즉시 옮깁니다. 파리는 3-5일 동안 연속적으로 사용할 수 있습니다
.
- 깨끗한 붓으로 한천에서 죽은 파리를 제거하고 한천을 깨뜨리지 않도록 주의하십시오.
- 한천 플레이트를 증류수로 헹구고 한천 표면에서 계란을 부드럽게 솔질하고 메쉬 위에 슬러리를 부어 계란을 수집합니다. 한천 플레이트에서 난자의 전부 또는 대부분이 제거될 때까지 3-4회 반복합니다.
3. 난자를 제거하고 무균 식단으로 전환
- 내부(측면 포함)에 70% 에탄올을 분사하여 생물 안전 캐비닛을 준비합니다. 실험실 티슈로 바닥을 닦고 자외선으로 후드를 ~15분 동안 살균합니다. 모든 비생물학적 용품(표본 컵, 페인트 브러시, 집게, 폐기물 용기, 400ml 멸균수 및 100ml 0.6% 차아염소산나트륨)을 에탄올을 분사하고 즉시 생물 안전 캐비닛에 넣어 살균합니다. 자외선으로 15분 동안 살균합니다.
- 계란이 든 부싱을 120ml 표본 컵 또는 기타 멸균 용기에 넣어 2번의 차아염소산나트륨 세척 중 첫 번째 세척을 시작합니다. 0.6% 차아염소산나트륨 용액 ~90ml를 테두리 바로 아래까지 부싱에 천천히 붓습니다.
- 2.5분 동안 계란을 헹굽니다. 집게를 사용하여 차아염소산염 용액에서 부싱을 위아래로 움직여 주기적으로 계란을 다시 매달아 놓습니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부에 90ml 표백제가 미리 채워진 두 번째 검체 컵에 부싱을 직접 옮깁니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부에서 3.3 단계를 반복하십시오. 두 번째 표백제 처리가 끝나면 계란이 부싱 측면에 달라붙기 시작해야 합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 3.7-3.8 단계를 수행하십시오.
- 표백제는 버리고 부싱을 멸균수로 3회 세척합니다. 집게로 부싱을 움직여 세탁하는 동안 계란을 여러 번 다시 매달아 두십시오. 세 번째 세척이 끝날 때까지 대부분의 계란은 부싱 측면에 부착되어야 합니다.
- 에탄올로 살균된 붓을 사용하여 부싱 측면에서 계란을 멸균 식단으로 옮깁니다. 난자를 개별적으로 또는 소량으로 옮깁니다. 바이알당 30-50개의 달걀을 목표로 합니다. 산소가 튜브로 들어갈 수 있도록 캡을 느슨하게 두십시오.