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$$\longrightharp{xx}$$,
이 프로토콜은 Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. 난자를 제거하고 멸균 식단으로 전환
- 내부(측면 포함)에 70% 에탄올을 분사하여 생물 안전 캐비닛을 준비합니다. 실험실 티슈로 바닥을 닦고 자외선으로 후드를 ~15분 동안 살균합니다. 모든 비생물학적 용품(표본 컵, 페인트 브러시, 집게, 폐기물 용기, 400ml 멸균수 및 100ml 0.6% 차아염소산나트륨)을 에탄올을 분사하고 즉시 생물 안전 캐비닛에 넣어 살균합니다. 자외선으로 15분 동안 살균합니다.
- 계란이 든 부싱을 120ml 표본 컵 또는 기타 멸균 용기에 넣어 2번의 차아염소산나트륨 세척 중 첫 번째 세척을 시작합니다. 0.6% 차아염소산나트륨 용액 ~90ml를 테두리 바로 아래까지 부싱에 천천히 붓습니다.
- 2.5분 동안 계란을 헹굽니다. 집게를 사용하여 차아염소산염 용액에서 부싱을 위아래로 움직여 주기적으로 계란을 다시 매달아 놓습니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부에 90ml 표백제가 미리 채워진 두 번째 검체 컵에 부싱을 직접 옮깁니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부에서 1.3 단계를 반복하십시오. 두 번째 표백제 처리가 끝나면 계란이 부싱 측면에 달라붙기 시작해야 합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 1.7-1.8 단계를 수행하십시오.
- 표백제는 버리고 부싱을 멸균수로 3회 세척합니다. 집게로 부싱을 움직여 세탁하는 동안 계란을 여러 번 다시 매달아 두십시오. 세 번째 세척이 끝날 때까지 대부분의 계란은 부싱 측면에 부착되어야 합니다.
- 에탄올로 살균된 붓을 사용하여 부싱 측면에서 계란을 멸균 식단으로 옮깁니다. 난자를 개별적으로 또는 소량으로 옮깁니다. 바이알당 30-50개의 달걀을 목표로 합니다. 산소가 튜브로 들어갈 수 있도록 캡을 느슨하게 두십시오. 바이알이 도끼질로 남아 있어야 하는 경우 곤충 인큐베이터로 옮기십시오. 그렇지 않으면 아래와 같이 박테리아를 추가하십시오.
2. 4 종의 박테리아를 사용하여 gnotobiotic 파리 만들기
- 박테리아 준비
- 1.1단계와 같이 필요한 소모품(피펫, 피펫 팁 상자, 멸균된 원심분리 튜브, MRS 육수 및 시험관 랙)이 포함된 멸균된 생물 안전 캐비닛을 준비합니다. 생물 안전 캐비닛에 넣기 전에 에탄올을 적신 실험실용 물티슈로 시험관 외부를 닦습니다.
- 먼저 하룻밤 사이에 자란 500μl를 멸균 마이크로퓨지 튜브로 옮겨 박테리아를 펠렛화합니다. 박테리아 밀도가 낮으면 각 튜브에 최대 1.5ml를 추가하거나 상층액을 순차적으로 제거하고 동일한 튜브에 추가 배양물을 추가합니다. 생물 안전 작업대에서 검체를 꺼내고 10,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 필터 팁을 사용하여 샘플 간 오염을 방지하십시오.
- OD600을 측정하여 각 배양의 밀도를 측정합니다. 멀티웰 플레이트 리더를 사용하는 경우 각 배양액 200μl를 1배, 2배 및 4배 희석하여 96웰 플레이트로 옮깁니다.
- 각 세포 펠릿을 희석할 mMRS의 양을 측정합니다(2.1.2) 플레이트 판독 분광 광도계와 다음 방정식을 사용하여 측정합니다. 각 플라이 바이알에 50μl를 접종할 수 있을 만큼 충분한 육수를 추가할 계획을 세웁니다.
- 플레이트 판독 분광 광도계에서 각 박테리아 배양액의 1:1, 1:2 및 1:4 희석을 위한 OD600 판독값을 수집합니다. 0.1과 0.2 사이의 OD600 값을 생성하는 각 박테리아 균주에 대한 희석을 선택하고 이 값과 해당 희석 계수를 2.1.4.2 또는 2.1.4.3에 제공된 공식에서 'O' 및 'D'로 사용합니다.
- 여기에 설명된 4종을 사용하는 경우, 세포를 등가 집락 형성 단위(CFU)/ml 밀도(OD600에서 이전에 Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol에서 결정된 CFU로의 변환)로 정규화합니다. (2014)) 다음 방정식을 사용합니다 :
E = ((O-B) x V x D)/C
여기서 E = 펠렛을 재현탁하기 위한 부피(μl), O = OD600 박테리아, B = OD600 블랭크 매체, D = 접기 희석, V = 원심분리 전 박테리아 배양 μl, C = 소정의 상수의 OD600. 이러한 방정식을 사용하는 계산의 예는 Supplemental Code File을 참조하십시오. 자동으로 비워지는 분광 광도계의 경우 "O-B" 대신 "O"를 사용합니다.
참고: 미리 결정된 상수(단위 OD600, 107 CFU ml-1로 정규화됨, Newell 및 Douglas, Appl Environ Microbiol에서 파생된 상수. (2014))는 A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077)이다.
- 다른 박테리아 종을 사용하는 경우(CFU/OD600 상수를 사용할 수 없음) 다음 방정식을 사용하여 밀도를 OD600 = 0.1로 정규화합니다
E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD600
참고: 단위는 2.1.4.2단계와 동일합니다. 이러한 방정식을 사용하는 계산의 예는 Supplemental Code File을 참조하십시오.
- 생물 안전 캐비닛에서 피펫 팁으로 상층액을 제거하고 2.1.4.2단계에서 계산한 대로 펠릿을 새 mMRS 또는 PBS에 다시 현탁시킵니다.
- 박테리아 접종
- 박테리아 50μl를 생물 안전 캐비닛에 있는 멸균 식단과 탈옥된 난자가 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 바이알 사이의 오염을 방지하기 위해 난자 이식 후 박테리아를 추가하십시오.
- 접종된 튜브를 25°C의 인큐베이터에 넣습니다.
3. CFU 부하 측정/무균 테스트
- 전신 플라이 균질액의 CFU 부하를 측정하려면 125μl의 세라믹 비드와 125μl의 mMRS 육수가 들어 있는 1.7ml 마이크로분리관에 파리 5마리(에클로젼 후 5-7일)를 옮깁니다. 조직 균질화기를 사용하여 4.0M/sec에서 30초 동안 파리를 균질화합니다.
- 또는 구슬을 생략하고 플라스틱 유봉이 있는 마이크로 원심분리기 튜브에서 1분 동안 손으로 균질화합니다.
- 장내 미생물군을 정량화하는 경우, 파리를 표면 살균하여 외인성 미생물을 제거합니다. 100μl 70% 에탄올이 포함된 마이크로 원심분리기 튜브로 1분 동안 이송한 후 에탄올을 흡인하고 균질화를 위해 새 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 장의 DNA 함량을 측정하는 경우 에탄올 세척 전에 0.6% 차아염소산나트륨으로 1분 동안 헹굽니다.
- 균질액을 875μl mMRS로 희석하고, 5초 동안 와류를 치고, 120μl의 균질액을 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 웰로 피펫합니다.
- 다음 두 웰에서 10 μl homogenate 및 70 μl MRS를 사용하여 두 번의 순차적 1:8 희석을 수행합니다.
- 첫 번째 웰에서 10μl를 제거하고 70μl MRS를 함유하는 두 번째 웰에 첨가합니다. 두 번째 웰의 내용물을 철저히 혼합하고, 두 번째 웰에서 70μl MRS를 함유하는 세 번째 웰로 10μl를 옮기고 철저히 혼합합니다. 이것은 원래 1,000 μl 균질산염의 3 총 농도로 이어집니다 : 희석되지 않은, 1 : 8 및 1 : 64.
- 각 희석액 10μl를 mMRS 플레이트로 옮깁니다(원하는 경우 다중 채널 피펫 사용). 접시를 약간 기울여 희석액을 한천 표면 아래로 몇 밀리미터 정도 펴고 접시를 이동하기 전에 액체가 건조되도록 합니다. 플레이트가 2일 된 경우 액체가 플레이트에서 빠르게 건조되어 인접한 두 방울의 혼합을 줄입니다.
- 30 °C에서 1-2 일 동안 배양하십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하면 개별 콜로니가 보이고 10-100개의 분리된 콜로니가 있는 희석에서 계산합니다.
- 방정식 E = C x D/P x V/F를 사용하여 플라이당 CFU를 계산하며, 여기서 E = 플라이당 CFU, C = 계수된 콜로니 수, D = 희석, P = μl 도금, V = 플라이 균질화의 부피, F = 균질화된 플라이 수.