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Abstract

출처: Guan, W., et al. 성인 표피를 통해 초파리 다리 운동 뉴런 축삭을 시각화합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 이미징 분석을 위해 신경근 조직을 그대로 보존하면서 초파리 성인 다리를 절개, 고정 및 장착하는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).

1. 다리 해부 및 고정

1. 유리로 된 멀티웰 플레이트를 가져와서 적절한 수의 웰에 70% 에탄올을 채웁니다. 각 웰에 15-20 CO₂ 마취 파리(성별 및 연령에 관계없이)를 추가하고 브러시를 사용하여 파리가 완전히 잠길 때까지 파리를 에탄올 용액에 부드럽게 두드립니다.
   참고: 이 단계는 큐티클의 소수성을 제거하는 것입니다. 1분 이상 세탁하지 마십시오, 큐티클의 자동 형광을 증가시키기 때문입니다.
2. 0.3x 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.3% 비이온성 계면활성제 세제 용액으로 파리를 3회 헹굽니다. 이 용액에 파리를 최소 10분 동안 보관하십시오.
   참고: 세제를 포함할 때 다리를 더 잘 고정할 수 있으며, 이는 다리 내부의 고정액의 침투를 증가시킬 수 있습니다.
3. 4% 파라포름알데히드(PFA) 튜브와 함께 얼음 위에 멀티 웰 플레이트를 놓습니다.
   참고: 16% PFA 에탄올이 없는 원액에서 신선한 4% PFA를 준비하는 것이 중요합니다.
4. 집게를 사용하여 흉부나 다리를 손상시키지 않고 파리의 머리와 복부를 제거합니다.
   참고: 복부를 제거하면 파리를 잡고 다리를 해부하는 것이 더 쉬워집니다.
5. 집게로 흉부 분절에서 다리를 절개하고 4% PFA가 함유된 웰에 다리를 놓습니다. 이를 위해 다리가 분리될 때까지 가는 집게 끝을 사용하여 콕사-흉부 접합부를 부드럽지만 단단히 누릅니다.
6. 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA로 다리를 고정합니다(총 약 20시간).
7. 0.3x PBS에 0.3% 비이온성 계면활성제 세제 용액을 넣고 다리를 1개, 5회 각각 20분 동안 세척합니다.
8. 세탁 버퍼를 장착 매체로 교체하십시오. 다리가 다리에 완전히 침투할 수 있도록 장착하기 전에 최소 하루 동안 다리를 장착 매체에 보관하십시오.
   참고: 장착 매체의 점성이 높은 경우 점도의 급격한 변화로 인해 큐티클이 무너지고 다리의 전체 구조가 손상될 수 있으므로 장착 매체를 1x PBS로 80%까지 희석하십시오. Gal4 드라이버에 따라 파리는 장착 매체에서 1°C에서 3주에서 4주까지 장착할 때까지 보존할 수 있습니다.

2. 레그 마운팅

1. 현미경 슬라이드의 왼쪽에 약 20μL의 70% 글리세롤을 놓고 정사각형 22 x 22mm² 커버슬립(그림 1A,B)으로 덮습니다. 이 커버슬립의 오른쪽 가장자리와 평행하고 약간 떨어진 선을 따라 약 10μL의 장착 매체를 피펫팅합니다. 슬라이드의 오른쪽에 30μL의 장착 매체를 더 추가합니다(그림 1C).
   참고: 다리 위에 커버슬립을 적용할 때(아래 참조) 장착 매체는 커버슬립을 옮기지 않고 커버슬립 아래와 다리 주위로 부드럽게 퍼집니다.
2. 가는 집게를 사용하여 용액에서 다리를 들어 올리고 왼쪽 커버슬립 근처의 장착 매체에 부드럽게 놓습니다. 각 다리에 대해 동일한 작업을 수행하고 위에서 아래로 정렬합니다(그림 1D).
   1. 집게의 양쪽 끝 사이에 있는 중간 방울로 다리를 들어 올려 옮깁니다. 다리를 두 가지 방법으로 방향: 바깥쪽을 위 또는 아래로 향하게 합니다.
3. 모든 다리(최대 6-8개의 다리를 장착할 수 있음)가 올바르게 정렬되면 이 커버슬립이 이전에 배치된 커버슬립 그림 1E에 약간 놓이도록 다리 위에 두 번째 커버슬립을 씌워 커버슬립과 조직 사이에 공간을 확보하고 다리가 손상되는 것을 방지합니다(그림 1G).
   참고: 또는 스티커 웰이나 교정 왁스를 사용하여 커버슬립과 슬라이드 사이에 공간을 만듭니다.
4. 매니큐어를 사용하여 각 모서리에서 커버슬립의 위치를 고정합니다(그림 1F).
   참고: 이제 조직을 이미지화할 준비가 되었습니다.

Representative Results

Materials

Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium