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이 프로토콜은 Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016)에서 발췌했습니다.
참고: 절차는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 온도 조절 인큐베이터는 달리 명시되지 않는 한 플라이 사육 및 교배를 위한 온도를 유지하는 데 사용됩니다.
1. 준비
사항
- 파리를 준비합니다.
- 전메타기가 풍부한 난모세포 컬렉션.
- 맑은 성충은 건강하고 어린 주식 또는 교차 문화에서 왔습니다. 25 °C에서 2 일 동안 병을 숙성시킵니다 .
참고: 일반적으로 두 개의 건강한 병으로 충분하지만 일부 교차 배양의 경우 더 많은 병이 필요할 수 있습니다.
- 이틀 후, 병에서 100 ~ 300 마리의 암컷 (이 시점에서 0-2 일)을 모으십시오. 암컷은 처녀일 필요가 없습니다. 바이알 측면에 이스트 페이스트를 약간 넣고 암컷 30마리와 수컷 10-15마리를 효모가 있는 바이알에 각각 넣습니다. 바이알을 25°C에서 2일 동안 숙성합니다.
- 메타기가 풍부한 난모 세포 컬렉션.
- 스톡 또는 교차 문화에서 ~100-300명의 암컷을 수집합니다. 바이알 측면에 이스트 페이스트를 약간 넣고 효모가 있는 바이알에 각각 암컷 30마리(수컷은 추가되지 않음)를 넣습니다. 바이알을 25°C에서 3일에서 5일 동안 숙성시킵니다.
- 솔루션 준비.
참고: 용액은 달리 명시되지 않는 한 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
- 변형 롭스 완충액 준비(5x): 500mM HEPES, 500mM 자당, 275mM 아세트산나트륨, 200mM 아세트산칼륨, 50mM 포도당, 6mM 염화마그네슘 및 5mM 염화칼슘. 10N 11:8 수산화나트륨:수산화칼륨을 사용하여 pH를 7.4로 높입니다. 여과에 의하여 살균하십시오; 오토클레이브하지 마십시오. -20 °C에서 보관하십시오. 필요에 따라 해동하여 난모세포 당 1x Robb's ~200ml를 준비합니다.
- 정착 해결책.
- 옵션 #1: 포름알데히드/헵탄 고정을 준비합니다. 고정 완충액 준비: 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 및 150mM 자당. 사용하려면 687.5 μl 고정 버퍼와 312.5 μl 16% 포름알데히드 per oocyte prep.
로 새로 만드십시오.
주의: 흄 후드에서 포름알데히드 용액을 사용하는 동안 장갑을 착용하십시오. 기관 지침에 따라 폐기물을 처리합니다.
- 옵션 #2: 포름알데히드/카코딜레이트 고정을 준비합니다. 수정 혼합물 준비: 250mM 자당, 100mM 아세트산칼륨(pH 7.5), 25mM 아세트산나트륨(pH 7.0) 및 25mM EGTA(pH 8.0). 사용하려면 400μl Fix Mix, 100μl 카코딜산 칼륨(1M, pH 7.2) 및 난모세포 prep.
당 500μl 16% 포름알데히드로 새로 만드십시오.
주의: 카코딜산 칼륨에는 비소가 포함되어 있습니다.
- PBS/Triton X-100 준비: PBS 1개에 1% 또는 0.05% Triton X-100을 더합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- PBS-Tween 20-소 혈청 알부민(BSA)(PTB) 준비: 1x PBS, 0.5% BSA(w/v) 및 0.1% Tween-20. 4 °C에서 일주일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 후기 초파리 난모세포 수집
- 멤브레인이 손상되지 않은 초파리 난모세포는 플라스틱과 유리에 달라붙기 때문에 난모세포 준비당 5ml 튜브 1개와 파스퇴르 피펫 1개의 내부를 PTB로 사전 코팅합니다.
- ~100-300마리의 효모 파리를 모두 이산화탄소로 마취하고 ~100ml 1x Robb's Buffer가 들어 있는 블렌더에 추가합니다. 펄스를 세 번 누릅니다(각 ~1초). 활성화를 피하기 위해 Robb's에 난모세포를 <20분 동안 유지합니다.
참고: 또는 암컷에서 난모세포를 손으로 해부할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 암컷이 덜 필요하다는 것입니다. 그러나 저산소증과 관련된 인공물을 피하기 위해 이산화탄소에 대한 노출을 단 몇 분으로 제한하도록 주의를 기울여야 합니다.
- 큰 메쉬(~1,500μm)를 250ml 비커에 여과하여 큰 신체 부위를 제거합니다. 메쉬에 손상되지 않은 복부가 많이 남아 있으면 추가 Robb's Buffer를 사용하여 재료를 다시 연마하고 다시 필터링합니다. ~2분 정도 가라앉힌 다음 윗층을 흡인하여 큰 신체 부위를 최대한 많이 제거합니다.
- 작은 메쉬(~300μm)를 통해 250ml 비커로 필터링합니다. 추가 Robb's 및 코팅된 파스퇴르 피펫을 사용하여 첫 번째 비커에서 남은 난모세포를 헹굽니다. ~ 3 분 동안 정착하십시오. 난모세포가 가라앉을 것입니다. ~10ml를 제외한 모든 것을 흡입하십시오.
- 코팅된 5ml 튜브에 들어갈 만큼 10ml를 붓습니다. 가라앉히고 액체를 제거하고 나머지로 반복합니다. 추가 Robb's 및 코팅된 파스퇴르 피펫을 사용하여 비커에서 남아 있는 난모세포를 헹굽니다. 5ml 튜브에 ~3-5분 동안 가라앉힙니다.
3. 약물 치료 (선택 사항)
- 각 난모세포 준비에 대해 두 번째 5ml 튜브에 PTB를 코팅합니다. 각 난모세포 준비에 대해 각각 1ml Robb에 적절한 용매(대조군) 또는 약물을 추가합니다(표 1).
- 난모세포를 두 번째 코팅된 5ml 튜브로 분할합니다. 가라앉히고 액체를 제거한 다음 1ml의 Robb's plus 용매를 하나의 튜브에 넣고 1ml의 Robb's plus 약물을 두 번째 튜브에 추가합니다. 약물 치료를 위한 적절한 시간 동안 nutate를 사용합니다(표 1). 정착합시다.
4. 고정
- 모든 액체를 흡입하고 즉시 1ml Fix를 추가합니다.
- 옵션 #1: 포름알데히드/헵탄 고정(고정 완충액과 5% 포름알데히드).
- 너트레이터에서 2.5분 동안 고정합니다. 헵탄 1ml와 와류를 1분 추가합니다. ~1분 정도 가라앉힙니다.
- 모든 액체를 제거한 다음 1ml 1x PBS를 추가합니다. 소용돌이 30 sec ~1분 정도 가라앉힙니다.
- 모든 액체를 제거한 다음 튜브에 1x PBS를 채웁니다.
참고: 난모세포는 즉시 사용하거나 실온에서 몇 시간 동안 너트에 보관할 수 있습니다.
- 옵션 #2: 포름알데히드/카코딜레이트 고정(Fix Mix와 8% 포름알데히드 및 100mM 카코딜레이트).
- 너트레이터에서 6분 동안 고정합니다. 2분 정도 가라앉힙니다. 액체를 제거한 다음 튜브에 1x PBS.
를 채웁니다.
참고: 난모세포는 즉시 사용하거나 실온에서 몇 시간 동안 너트에 보관할 수 있습니다.
5. 멤브레인 제거 ("롤링")
- 코팅된 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 슬라이드의 젖빛(샌드 블라스팅) 부분에 ~500-1,000개의 난모세포를 추가합니다. 집게를 사용하여 모든 신체 부위와 외부 물질을 제거합니다. 난모세포가 마르지 않도록 하십시오. 필요에 따라 PBS 1개를 추가합니다.
- 난모세포 위에 커버슬립을 놓고 모든 막이 제거될 때까지 난모세포를 부드럽게 "굴립니다"(난모세포를 가로질러 커버슬립의 가장자리를 드래그하는 것이 가장 효과적입니다). 현미경으로 주기적으로 진행 상황을 확인하고 필요에 따라 1x PBS를 더 추가합니다. 너무 많은 압력은 난모세포를 파괴할 수 있으므로 주의하십시오.