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이 프로토콜은 Perkins and Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.
1. 코리온(Chorions) 및 비텔린막(Vitelline membranes) 제거
참고: 필요한 도구는 그림 1을 참조하십시오.
- 말기 난모세포 분리
- 얕은 해부 접시에 PBSBTx 1mL를 추가합니다. BSA 코팅된 팁이 있는 P200을 사용하여 고정 난소(~150μL)를 얕은 접시로 옮깁니다. 피펫은 BSA 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 움직여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다.
- 후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500μL 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 당겨 과도한 액체를 제거하고 튜브에 약 150 - 200 μL를 남겨둡니다. 나머지 유전자형에 대해 섹션 1.1을 반복합니다.
- 롤링 준비
- 깊은 웰 디쉬에 200μL의 PBSBTx를 미리 적십니다. 뚜껑을 덮고 따로 보관합니다. 젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 #3을 한쪽에 둡니다. 슬라이드 #1과 #2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오.
- 한 슬라이드에 50μL의 PBSBTx를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 #1 및 #2의 서리로 덥은 영역을 PBSBTx로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 물기를 제거하십시오.
- 그림 2 A에 표시된 구성으로 해부 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 #1 및 #2의 서리로 덥은 영역이 접촉하도록 하고 슬라이드 #3이 슬라이드 #2를 지지하도록 합니다.
- 난모세포를 굴립니다. 구르는 방향이 항상 직선이 되고 결코 원을 그리지 않도록 합니다.
- P200 피펫 팁을 PBSBTx에 미리 적시고 위아래로 피펫팅하여 마이크로분리 튜브의 난모세포를 분산시킵니다. 난모세포를 포함하는 액체 50μL를 슬라이드 #1의 젖빛 유리 부분 중앙으로 옮깁니다. 이렇게 하려면 슬라이드 #2를 들어 올립니다.
- 액체의 표면 장력이 두 개의 젖빛 유리 영역 사이에 밀봉을 생성할 때까지 슬라이드 #2를 천천히 내립니다. 서리가 내린 부분을 덮을 수 있을 만큼 충분한 액체가 있어야 하지만 아무 것도 새어 나오지 않아야 합니다. 액체가 넘치면 당겨진 파스퇴르 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오.
- 한 손으로 하단 슬라이드(#1)를 제자리에 잡고 다른 손을 사용하여 상단 슬라이드(#2)를 수평 방향으로 앞뒤로 움직여 슬라이드 #2를 수평으로 유지하고 슬라이드 #3에서 지지합니다. 난모세포의 움직임과 진행 상황을 쉽게 시각화할 수 있도록 현미경 아래에서 수행합니다.
참고: 이 움직임은 마찰을 일으키고 난모세포가 "굴러가고" 맥락막을 잃게 합니다. 최소한의 압력을 사용해야 하며 움직임은 짧고 빨라야 합니다.
- 수평 방향으로 몇 번 움직인 후 이동 각도를 약간 변경합니다(그림 2B). 여러 증분으로 상단 슬라이드의 이동이 시작 방향에 수직이 될 때까지 이 각도를 점차적으로 90°로 높입니다(그림 2B). 빈 맥락막은 액체에서 볼 수 있으며 맥락막이 없는 난모세포는 더 길고 얇게 보입니다.
- 용액이 약간 흐려질 때까지 1.3.3 - 1.3.4 단계를 약 7 - 10회 반복합니다. 대부분의 난모세포(75 - 85%)가 유리막을 잃은 것으로 보이면 롤링을 중단하십시오.
참고: 독특한 뾰족한 끝은 유리막이 없는 난모세포에서 종종 볼 수 있습니다. Vitelline 멤브레인은 융모막보다 제거하기가 더 어렵습니다. 유리체 멤브레인을 제거하기 위해 롤링하는 동안 상단 슬라이드(슬라이드 #2)에 가벼운 압력이 가해질 수 있습니다. 모든 난모세포에서 유리막을 제거하려고 하면 종종 다른 난모세포가 파괴됩니다.
- 상단 슬라이드(#2)를 부드럽게 들어 올려 모서리 중 하나를 하단 슬라이드(#1)의 서리 영역 중앙으로 드래그하여 롤링된 난모세포가 서리 영역의 중앙에 축적되도록 합니다. PBSBTx가 포함된 두 슬라이드의 난모세포를 PBSBTx가 들어 있는 깊은 웰 접시에 헹굽니다.
- 슬라이드 #1과 #2를 초순수로 세척하고 일회용 물티슈로 건조시킨 다음 재설정합니다. 동일한 유전자형의 모든 난모세포가 굴러갈 때까지 1.3.1 - 1.3.6 단계를 반복합니다. 이것은 일반적으로 유전자형당 3-4 라운드의 롤링이 필요합니다.
- 압연 후 이물질 제거
- 15mL 코니컬 튜브에 1mL PBSBTx를 추가합니다. 액체를 휘젓어 튜브의 측면을 코팅합니다.
- PBSBTx 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 깊은 웰 접시에서 롤링된 난모세포를 1mL의 PBSBTx가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 난모세포가 들어 있는 원뿔형 튜브에 PBSBTx 2mL를 추가로 추가합니다.
- 난모세포가 바닥에 가라앉기 시작하도록 한 다음 P1000으로 파편(chorions, vitelline 등)이 포함된 용액의 상단 2mL를 제거하고 폐기합니다. 필요한 경우 어두운 배경에 원뿔형 튜브를 대고 가라앉는 불투명한 난모세포를 확인합니다.
- 난모세포에 PBSBTx 2mL를 추가로 첨가하고 1.4.3단계를 반복합니다. 1.4.3을 반복합니다. 총 3 라운드의 파편 제거.
- PBSBTx 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 난모세포를 원래의 500 μL 마이크로분리 튜브로 다시 이동시킵니다.20 - 25명의 암컷은 약 50 μL의 성숙한 난모세포를 생성해야 합니다.
- 각 유전자형에 대해 새로운 서리로 덥은 슬라이드, 깨끗하고 깊은 우물 접시 및 새 원추형 튜브를 사용하여 나머지 유전자형에 대해 섹션 4를 반복합니다.
- 보관이 필요한 경우 0.1% TritionX-100이 함유된 난모세포를 1x PBS로 옮기고 4°C에서 밤새 보관하십시오. 포름알데히드 가교는 비이온 세제에 의해 역전될 수 있으므로 장기 보관은 권장되지 않습니다.
