방법 논문

Chorion and Vitelline membrane mechanical removal: 직접 관찰을 위해 초파리 난모세포를 준비하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Perkins, A. T., Bickel, S. E. FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)를 사용하여 전중기 및 중기 I 초파리 난모세포의 팔 응집력 상태를 모니터링합니다. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 이전에 고정된 성숙한 초파리 난모세포에서 융모막과 유리막을 기계적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 형광 in situ hybridization assay와 호환되는 난모세포를 생성하는 절차에 대한 자세한 시연을 보여줍니다.

프로토콜

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이 프로토콜은 Perkins and Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

1. 코리온(Chorions) 및 비텔린막(Vitelline membranes) 제거

참고: 필요한 도구는 그림 1을 참조하십시오.

  1. 말기 난모세포 분리
    1. 얕은 해부 접시에 PBSBTx 1mL를 추가합니다. BSA 코팅된 팁이 있는 P200을 사용하여 고정 난소(~150μL)를 얕은 접시로 옮깁니다. 피펫은 BSA 코팅된 피펫 팁으로 난소를 위아래로 움직여 덜 성숙한 난모세포에서 성숙한 난모세포를 제거합니다.
    2. 후기 단계의 난모세포가 충분히 분리되면 모든 조직을 500μL 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 당겨 과도한 액체를 제거하고 튜브에 약 150 - 200 μL를 남겨둡니다. 나머지 유전자형에 대해 섹션 1.1을 반복합니다.
  2. 롤링 준비
    1. 깊은 웰 디쉬에 200μL의 PBSBTx를 미리 적십니다. 뚜껑을 덮고 따로 보관합니다. 젖빛 유리 슬라이드 3개를 얻고 슬라이드 #3을 한쪽에 둡니다. 슬라이드 #1과 #2의 젖빛 유리 부분을 함께 부드럽게 문지릅니다. 탈이온수로 헹구어 유리 파편을 제거하고 일회용 물티슈로 말리십시오.
    2. 한 슬라이드에 50μL의 PBSBTx를 추가하고 이 영역을 다른 슬라이드로 문질러 슬라이드 #1 및 #2의 서리로 덥은 영역을 PBSBTx로 코팅합니다. 일회용 물티슈로 물기를 제거하십시오.
    3. 그림 2 A에 표시된 구성으로 해부 현미경 아래에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 #1 및 #2의 서리로 덥은 영역이 접촉하도록 하고 슬라이드 #3이 슬라이드 #2를 지지하도록 합니다.
  3. 난모세포를 굴립니다. 구르는 방향이 항상 직선이 되고 결코 원을 그리지 않도록 합니다.
    1. P200 피펫 팁을 PBSBTx에 미리 적시고 위아래로 피펫팅하여 마이크로분리 튜브의 난모세포를 분산시킵니다. 난모세포를 포함하는 액체 50μL를 슬라이드 #1의 젖빛 유리 부분 중앙으로 옮깁니다. 이렇게 하려면 슬라이드 #2를 들어 올립니다.
    2. 액체의 표면 장력이 두 개의 젖빛 유리 영역 사이에 밀봉을 생성할 때까지 슬라이드 #2를 천천히 내립니다. 서리가 내린 부분을 덮을 수 있을 만큼 충분한 액체가 있어야 하지만 아무 것도 새어 나오지 않아야 합니다. 액체가 넘치면 당겨진 파스퇴르 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오.
    3. 한 손으로 하단 슬라이드(#1)를 제자리에 잡고 다른 손을 사용하여 상단 슬라이드(#2)를 수평 방향으로 앞뒤로 움직여 슬라이드 #2를 수평으로 유지하고 슬라이드 #3에서 지지합니다. 난모세포의 움직임과 진행 상황을 쉽게 시각화할 수 있도록 현미경 아래에서 수행합니다.
      참고: 이 움직임은 마찰을 일으키고 난모세포가 "굴러가고" 맥락막을 잃게 합니다. 최소한의 압력을 사용해야 하며 움직임은 짧고 빨라야 합니다.
    4. 수평 방향으로 몇 번 움직인 후 이동 각도를 약간 변경합니다(그림 2B). 여러 증분으로 상단 슬라이드의 이동이 시작 방향에 수직이 될 때까지 이 각도를 점차적으로 90°로 높입니다(그림 2B). 빈 맥락막은 액체에서 볼 수 있으며 맥락막이 없는 난모세포는 더 길고 얇게 보입니다.
    5. 용액이 약간 흐려질 때까지 1.3.3 - 1.3.4 단계를 약 7 - 10회 반복합니다. 대부분의 난모세포(75 - 85%)가 유리막을 잃은 것으로 보이면 롤링을 중단하십시오.
      참고: 독특한 뾰족한 끝은 유리막이 없는 난모세포에서 종종 볼 수 있습니다. Vitelline 멤브레인은 융모막보다 제거하기가 더 어렵습니다. 유리체 멤브레인을 제거하기 위해 롤링하는 동안 상단 슬라이드(슬라이드 #2)에 가벼운 압력이 가해질 수 있습니다. 모든 난모세포에서 유리막을 제거하려고 하면 종종 다른 난모세포가 파괴됩니다.
    6. 상단 슬라이드(#2)를 부드럽게 들어 올려 모서리 중 하나를 하단 슬라이드(#1)의 서리 영역 중앙으로 드래그하여 롤링된 난모세포가 서리 영역의 중앙에 축적되도록 합니다. PBSBTx가 포함된 두 슬라이드의 난모세포를 PBSBTx가 들어 있는 깊은 웰 접시에 헹굽니다.
    7. 슬라이드 #1과 #2를 초순수로 세척하고 일회용 물티슈로 건조시킨 다음 재설정합니다. 동일한 유전자형의 모든 난모세포가 굴러갈 때까지 1.3.1 - 1.3.6 단계를 반복합니다. 이것은 일반적으로 유전자형당 3-4 라운드의 롤링이 필요합니다.
  4. 압연 후 이물질 제거
    1. 15mL 코니컬 튜브에 1mL PBSBTx를 추가합니다. 액체를 휘젓어 튜브의 측면을 코팅합니다.
    2. PBSBTx 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 깊은 웰 접시에서 롤링된 난모세포를 1mL의 PBSBTx가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 난모세포가 들어 있는 원뿔형 튜브에 PBSBTx 2mL를 추가로 추가합니다.
    3. 난모세포가 바닥에 가라앉기 시작하도록 한 다음 P1000으로 파편(chorions, vitelline )이 포함된 용액의 상단 2mL를 제거하고 폐기합니다. 필요한 경우 어두운 배경에 원뿔형 튜브를 대고 가라앉는 불투명한 난모세포를 확인합니다.
    4. 난모세포에 PBSBTx 2mL를 추가로 첨가하고 1.4.3단계를 반복합니다. 1.4.3을 반복합니다. 총 3 라운드의 파편 제거.
    5. PBSBTx 코팅된 P1000 피펫 팁을 사용하여 난모세포를 원래의 500 μL 마이크로분리 튜브로 다시 이동시킵니다.20 - 25명의 암컷은 약 50 μL의 성숙한 난모세포를 생성해야 합니다.
  5. 각 유전자형에 대해 새로운 서리로 덥은 슬라이드, 깨끗하고 깊은 우물 접시 및 새 원추형 튜브를 사용하여 나머지 유전자형에 대해 섹션 4를 반복합니다.
  6. 보관이 필요한 경우 0.1% TritionX-100이 함유된 난모세포를 1x PBS로 옮기고 4°C에서 밤새 보관하십시오. 포름알데히드 가교는 비이온 세제에 의해 역전될 수 있으므로 장기 보관은 권장되지 않습니다.

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결과

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figure-results-1
그림 1: 세포학 도구. 프로토콜에 사용되는 도구: (1) 한 쌍의 집게(#5 Dumont); (2) 텅스텐 바늘; (3) 덮개가 있는 깊은 우물 접시; (4) 얕은 유리 해부 접시; (5) 파스퇴르 피펫을 뽑았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 롤링 난모세포를 위한 슬라이드의 배열 및 이동. (A) 프로...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민(BSA)피셔 사이언티픽BP1600-10010% 재고 준비
동결 부분 표본
트리톤 X-100 10%써모 사이언티픽(Thermo Scientific28314Surfact-Amps
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% 트리션 X-100
집게뒤몽#5 이녹스, 바이오로지
9 "일회용 유리 파스퇴르 피펫어부13-678-20씨살균을 위한 오토클레이브
얕은 유리 해부 접시맞춤 제작
깊은 우물 접시 (3 우물)파이렉스7223-34
텅스텐 바늘만든
반투명 유리 슬라이드, 25 x 75mmVWR 사이언티픽제48312-002
15 mL 코니컬 튜브다양한
500 μl 마이크로분리관다양한
킴와이프다양한일회용 물티슈
) 년 호

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PBSBTx

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