큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

초록

출처: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. 초파리 유충의 림프선과 혈구를 검사하는 방법. J. Vis. 특급 (2016).

초파리 혈림프는 혈액과 간질액의 역할을 하며 유충과 성충 단계에서 몸 전체를 순환합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 유충 혈림프를 수집하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Reimels와 Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila larvae, J. Vis. Exp.(2016).

1. 순환 혈구 농도

1. 이 분석에서 거의 동일한 발달 단계의 유충을 얻으려면 암컷이 2-6시간의 고정된 시간 동안 알을 낳을 수 있도록 하여 난자 수집을 제한합니다.
2. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 해부 접시 우물에서 유충을 수집합니다.
3. 각 유충에 대해 얼음 위의 미세 원심분리 튜브에 10μl 1x PBS를 넣고 깨끗한 해부 패드에 10μl 1x PBS를 놓습니다. 조명이 켜진 실체현미경 베이스에 해부 패드를 놓습니다.
4. 개별 유충을 해부 패드의 PBS 드롭으로 옮기기 전에 티슈 물티슈에 올려 건조시킵니다.
5. 집게를 사용하여 큐티클을 부드럽게 찢고 조심스럽게 뒤집어 혈림프를 풀어줍니다.
   참고: 큐티클을 긁거나 찔러서는 잠재적으로 고착성 혈구를 방출할 수 있으므로 주의하십시오.
6. 피펫을 사용하여 해부 패드에서 혈림프를 수집합니다. 뚱뚱한 몸체와 같은 유충 찌꺼기를 모으지 마십시오.
7. 미세 원심분리 튜브에 혈림프를 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
   참고: 한 번에 여러 샘플을 채취하여 최대 한 시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
8. 선택 사항: Trypan blue와 혈림 검체를 동일한 비율로 혼합하여 죽은 세포를 염색하고 제외합니다. 트리판 블루는 세포에 독성이 있으므로 첨가 후 3분 이내에 세포 수를 세십시오.
9. 혈구계 챔버에 10 μl를 로딩하기 전에 위아래로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
10. 자동화된 셀 카운터를 사용하는 경우 셀 크기 및 원형도에 대한 적절한 매개변수를 설정합니다. 예를 들어, 최소 셀 크기를 2μm, 최대 셀 크기를 22μm, 진원도를 75 - 80% 진원도로 설정하여 정상적인 원형 적혈구를 검출합니다. 층상세포(lamellocyte)와 같은 더 크고 방추형 형태의 혈구를 검출하기 위해 다양한 매개변수로 실험해 보십시오. 또는 혈구계를 사용하여 수동으로 혈구를 계수합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS 정제	MP 바이오메디컬	2810305
해부 접시	코 닝	7220-85
마이크로 원심분리기 튜브	덴빌	C2170
실리콘 해부 패드, Sylgard 184 키트로 제작	Krayden (Fisher를 통해 배포)	NC9644388(Fisher 카탈로그 번호)	제조사 지침에 따라 Sylgard 엘라스토머 키트의 구성 요소를 혼합하여 페트리 접시에서 만들어졌습니다.
실체현미경	Morrell Instruments (니콘 대리점)	MNA42000, MMA36300	니콘 모델 SMZ1000 및 SMZ645
티슈 와이프	폭스바겐	82003-820년
집게	전자 현미경 과학	72700-DZ
P200 피펫	에펜도르프	3120000054
Countess 자동 세포 계수기	인비트로젠	C10227
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드	인비트로젠	C10283
혈구계	Hausser 사이언티픽	3200
TRYPAN 블루 스테인	생명 기술	T10282

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