파리 번데기에서 눈-뇌 복합체의 해부: 망막 조직을 분리하는 방법

Abstract

출처: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. 면역조직화학, 서양 분석 및 RNA 분리를 위한 초파리 번데기 망막 해부. J. Vis. 특급(2019).

이 비디오는 번데기에서 눈-뇌 복합체를 해부하고 분리하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 예를 들어 면역 염색 및 다른 유전자 발현 실험과 호환되는 고품질 조직을 생성하는 절차를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 DeAngelis and Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation에서 발췌한 것입니다. J. Vis. Exp.(2019).

1. 조직 준비

1. 초파리 교배(이전에 Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)에 기술된 바와 같이) 또는 배양 특정 초파리 균주를 설정하여 원하는 유전자형의 번데기를 얻습니다. 많은 수의 번데기가 우연히 출현하도록 하려면 영양이 풍부한 식품 배지 또는 효모 페이스트가 넉넉하게 보충된 표준 식품 배지에 이러한 파리 배양을 복제하여 확립하십시오.
2. 초파리 배양을 25°C에서 유지합니다. UAS-GAL4 시스템을 활용하는 교배의 경우, GMR-GAL4는 형태발생학적 고랑 뒤쪽과 번데기 발달 전반에 걸쳐 유충 안구 디스크 세포에서 발현되는 이상적인 동인입니다. 교차 UAS-lacZ X GMR-GAL4는 비내인성 및 불활성 β-갈락토시다아제 단백질의 발현을 유도하기 때문에 이상적인 제어 교차 역할을 합니다.
3. 증류수에 적신 6인치 대나무 부목의 끝을 사용하여 건강한 배양 바이알(<>그림 1 A)의 측면에서 흰색 번데기(strong class="xfig"그림 1B)를 부드럽게 들어 올려 1.5mL 미세 원심분리 튜브(그림 1C)에 넣습니다.
4. 번데기가 건조되는 것을 방지할 수 있도록 챔버를 충분한 습도로 유지하기 위해 증류수에 적신 작은 조직 조각과 함께 튜브를 플라스틱 피펫 팁 상자에 넣습니다(그림 1, D). 번데기를 해부할 때까지 25°C에서 배양합니다.
5. 마른 6인치 대나무 부목을 사용하여 미세 원심분리기 튜브에서 번데기를 부드럽게 밀어 검은색 해부 접시 위로 밀어 넣습니다. 번데기에서 멀리 떨어진 해부 접시에 새 양면 테이프 조각을 놓습니다.
6. 한 쌍의 집게를 사용하여 번데기 등쪽이 위로 향하게 하여(즉, 수술이 위를 향함, 그림 1B) 테이프(그림 2 A)에 조심스럽게 놓습니다. 번데기가 테이프에 잘 부착되어 있는지 확인하십시오.
   참고: 번데기 케이스의 습기는 테이프에 대한 안전한 접착을 방해하며, 이 경우 양면 테이프에 부착하기 전에 번데기를 자연 건조시키십시오.

2. 눈-뇌 복합체 해부

1. 집게를 사용하여 각 번데기의 수술을 제거합니다(그림 2C).
2. 현미해부 가위를 사용하여 각 번데기의 번데기 케이스를 자르거나 자릅니다. 번데기 케이스를 플랩으로 열어 머리, 흉부 및 전방 복부 부분을 드러내고 번데기 케이스의 가장자리를 양면 테이프에 고정합니다(그림 2C).
   참고: 번데기를 완전히 드러낼 필요는 없습니다.
3. 날카로운 집게로 각 번데기의 복부를 뚫어 동물을 잡고 번데기 케이스에서 제거합니다(그림 2C).
4. 번데기를 테이프에서 떨어진 검은색 해부 접시에 놓고 약 400μL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 용액(PBS, pH 7.4)으로 덮습니다.
5. 집게로 각 번데기의 복부를 잡고 미세 해부 가위로 흉부 전체를 깨끗하게 단면적으로 잘라 번데기를 반으로 자릅니다(그림 2D).
6. PBS에서 각 도체의 뒤쪽 잔여물을 제거하고 해부 접시의 한쪽 면에 놓습니다(버리지 마십시오. 3.2.1단계 참조).
7. 두 쌍의 가는 집게를 사용하여 각 번데기의 흉부와 머리를 열어 눈-뇌 복합체를 드러냅니다(그림 2E). 이렇게 하려면 흉부 상피의 절단된 가장자리를 잡고 서서히 찢어 흉부를 연 다음 머리 캡슐을 열어 눈-뇌 복합체와 주변 지방 조직을 노출시킵니다.
8. 조직을 잡지 않고 집게를 사용하여 눈-뇌 복합체를 두낭의 잔해에서 멀어지게 하거나 찢어진 두낭에서 눈-뇌 복합체를 퍼냅니다.
   참고: 눈-뇌 복합체는 덤벨 모양이고 회백색이며 주변의 크림색 지방(그림 2B,E)보다 더 반투명합니다.
9. 겸자로 눈 조직을 건드리지 않고 눈-뇌 복합체와 관련된 대부분의 지방을 조심스럽게 제거합니다.

3. 면역형광을 위한 조직 가공

1. 설명된 대로 최소 6-10마리의 번데기를 해부합니다(2.1-2.9단계).
   참고: 각 해부에 대한 3-4개의 독립적인 반복실험은 가설을 검증하기에 충분한 데이터를 산출하는 경향이 있습니다.
2. 세척 및 고정
   1. 깨끗한 면도날로 P20 또는 P100 피펫 팁의 끝을 잘라 팁 입구를 반경 ~1mm로 늘리고 PBS와 지방을 위아래로 혼합하여 피펫팅하여 윤활합니다. 이 지방은 2.6단계에서 제거한 도체 잔해에서 얻을 수 있습니다.
   2. 얼음 위에서 9웰 유리 접시에 담긴 눈-뇌 복합체를 ~400μL의 PBS로 옮깁니다. 윤활 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 마이크로피펫을 사용하여 전사합니다.
      참고: 눈-뇌 복합체는 피펫팅 중에 윤활되지 않은 팁에 달라붙어 손상되거나 분실됩니다.
   3. PBS를 위아래로 피펫팅하여 눈-뇌 복합체를 부드럽게 소용돌이쳐 눈 조직과 관련된 남아 있는 지방을 제거합니다. 이 세척 단계와 이후의 모든 세척 단계에서 연약한 눈 조직을 손상시킬 수 있으므로 눈-뇌 복합체를 위아래로 직접 피펫팅하지 마십시오.
   4. 최소 부피(<20 μL)의 PBS에 있는 눈-뇌 복합체를 최소 250 μL의 고정제로 전달합니다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에서 35분 동안 배양합니다.
      참고: 3.1.1단계에서 준비한 것과 동일한 윤활 팁을 이 전송에 사용할 수 있습니다.
   5. 동일한 피펫 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 ~400μL의 PBS가 함유된 웰로 옮깁니다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 얼음 위에서 5-10분 동안 배양하여 세척합니다. 세탁 단계를 두 번 이상 반복하십시오.
      참고: 눈-뇌 복합체는 3.3.1단계로 진행하기 전에 최종 PBS 세척, 얼음 또는 4°C에서 몇 시간 동안 유지할 수 있습니다.
3. 항체 염색
   1. 항체 용액에 노출되기 전에 조직을 차단하려면 눈-뇌 복합체를 ~400μL의 PBT로 옮깁니다. 이송을 위해 윤활 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 마이크로피펫을 사용합니다. 얼음 위에서 10-60분 동안 배양합니다.
   2. PBT에 적절한 항체를 희석하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 눈-뇌 복합체는 10μL의 항체 분취액에서 배양되기 때문에 준비된 부피는 10의 복제물이 됩니다.
   3. 10μL의 항체 용액을 72웰 마이크로웰 트레이의 깨끗한 웰에 분취합니다.
   4. 깨끗한 면도날로 P10 파이펫 팁의 끝을 잘라 팁 입구를 반경 ~0.5mm로 늘리고 PBT를 위아래로 파이펫팅하여 윤활합니다.
   5. P10 공기 치환 마이크로피펫과 윤활 팁을 사용하여 <3μL 부피의 PBS에서 5개 이하의 눈-뇌 복합체를 각 10μL 웰의 항체 용액으로 이동시킵니다.
   6. 항체 용액을 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다. 안-뇌 복합체를 위아래로 피펫팅하면 조직이 손상될 수 있으므로 피펫을 사용하지 마십시오.
   7. 항체 용액의 증발을 최소화하려면 증류수에 적신 작은 조직 조각을 마이크로웰 트레이에 넣고 트레이를 밀봉합니다(예: 제공된 뚜껑으로). 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
   8. 마이크로웰 트레이의 눈-뇌 복합체를 9웰 유리 접시에 담긴 ~400μL의 PBT로 옮겨 세척합니다. P10 공기 변위 마이크로피펫 및 PBT 윤활 팁을 사용합니다(3.3.4단계에서 설명한 대로 준비). 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에서 5-10분 동안 배양합니다.
   9. 세탁 단계를 최소 두 번 반복하십시오. P20 또는 P100 공기 치환 마이크로피펫과 PBT 윤활 팁을 사용하여 세척 용액 사이에 눈-뇌 복합체를 전달합니다.
   10. 필요에 따라 PBT에 적절한 형광단 태그가 지정된 2차 항체를 희석하여 2차 항체 용액을 준비합니다.6-10마리의 번데기 배치당 100μL의 2차 항체 용액으로 충분합니다. 2차 항체 용액을 9웰 유리 해부 접시에 분취합니다.
   11. 눈-뇌 복합체를 2차 항체 용액으로 전달합니다. P20 또는 P100 공기 변위 마이크로피펫과 PBT 윤활 팁을 사용하여 전송합니다.
   12. 2차 항체 용액에서 눈-뇌 복합체를 실온에서 1-2시간 또는 4°C에서 3-5시간 동안 배양합니다. 빛에 의한 형광단의 표백을 방지하려면 제제를 호일로 덮으십시오.
       참고: 2차 항체 용액에서의 최적 배양 기간은 사용된 1차 및 2차 항체에 따라 다를 수 있습니다.
   13. 눈-뇌 복합체를 9-well 유리 접시에 담긴 ~400μL의 PBT로 옮겨 세척합니다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에서 5-10분 동안 배양합니다. 이 세척 단계는 최소 두 번 반복해야 합니다.
4. 2차 정착
   1. 2차 고정의 경우, 눈-뇌 복합체를 최소 200μL의 고정액으로 옮기고 실온에서 20분 또는 4°C에서 35분 동안 배양합니다.
      참고: 2차 고정은 눈 조직을 뻣뻣하게 하여 장착을 돕습니다(3.5단계).
   2. P20 또는 P100 공기 변위 마이크로피펫과 PBT 윤활 팁을 사용하여 9웰 유리 접시에 담긴 눈-뇌 복합체를 ~400μL의 PBT로 얼음 위에서 5분 동안 세척합니다.
   3. 세탁 단계를 한 번 이상 반복하십시오.
   4. P20 또는 P100 공기 치환 마이크로피펫과 PBT 윤활 팁을 사용하여 9웰 유리 접시에 담긴 눈-뇌 복합체를 ~400μL의 PBS로 얼음 위에 올려 1-2분 동안 헹굽니다. PBS를 헹구는 동안 눈-뇌 복합체가 유리 접시에 침전되어 달라붙는 것을 방지하기 위해 조직이 아닌 PBS를 위아래로 피펫팅하여 조직을 계속 움직이게 합니다.
5. 장착
   1. 눈-뇌 복합체를 ~200μL의 장착 매체로 옮깁니다. P20 또는 P100 공기 치환 마이크로피펫과 PBT 윤활 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 전달합니다. 조직이 1-2시간 동안 장착 매체에서 평형을 이루도록 합니다.
   2. 5-8 μL의 새로운 장착 매체를 깨끗한 현미경 슬라이드에 떨어뜨립니다.
   3. 깨끗한 면도날로 P10 팁을 절단하여 팁 개구부를 반경 ~0.5mm로 늘리고 이 핀과 P10 공기 변위 마이크로피펫을 사용하여 5-8μL의 장착 매체에 있는 눈-뇌 복합체를 슬라이드의 장착 매체 드롭으로 이동합니다.
   4. 두 개의 텅스텐 바늘을 사용하여 눈과 시신경을 분리합니다. 튼튼한 텅스텐 바늘로 눈-뇌 복합체를 슬라이드에 고정하고 미세한 텅스텐 바늘(그림 2 F)로 관련 시엽에서 각 눈을 잘라냅니다.
   5. 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 각 눈의 기저 표면이 슬라이드에 인접한 현미경 슬라이드 표면으로 각 눈을 움직입니다. 깨끗한 커버 슬립을 티슈 위로 부드럽게 내리고 매니큐어로 고정합니다.
      참고: 슬라이드에 눈을 서로 가까이 또는 일렬로 배치하면 후속 현미경 검사가 용이해집니다.
   6. 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 망막을 이미지화합니다.
      참고: 슬라이드는 즉시 이미지화하지 않는 경우 4°C에서 보관해야 합니다.

Results

그림 1: 해부를 위한 번데기의 선택과 배양. (A) 방황하는 세 번째 유충 instar (L3) 유충과 번데기는 건강한 초파리 배양의 측면을 따라 위치합니다. (B) 번데기 이전은 보호용 번데기 케이스에서 아직 색소가 생성되지 않았기 때문에 반투명한 흰색으로 식별할 수 있습니다. 번데기의 전방-후방 및 등-복부 축은 파란색으로 표시됩니다. 축축한 대나무 부목은 유리병 벽에서 번데기 이전의 번데기를 제거하고 선택하는 데 사용됩니다. (C) 번데기는 적절하게 라벨링된 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고(유전자형, 채취 날짜 및 채취 시간) (D) 빈 피펫 팁 상자에서 조립된 가습 챔버 내에서 배양합니다. 습도는 상자...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
대나무 부목, 6"	테드 펠라 Inc	116
블랙 해부 접시			SYLG170 또는 SYLG184(곱게 빻은 숯 가루로 검은색)으로 테두리까지 채워진 유리 페트리 접시. 중합을 위해 24-48시간 동안 실온에 두십시오.
블레이드 홀더	정밀 과학 도구	10053
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A7906
양면 테이프	3엠	665
초파리 & 식품 매체, 영양이 풍부합니다.			7.5% 자당, 15% 포도당, 2.5% 한천, 20% 맥주 효모, 5% 펩톤, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& 식품 매체, 표준			블루밍턴 초파리 스톡 센터 옥수수 가루 레시피. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
고착 용액			PBS의 4% 포마데히드, pH 7.4.
집게	정밀 과학 도구	91150-20	집게는 자주 날카롭게 해야 합니다.
포름알데히드	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	28908
유리 9웰 접시	코 닝	7220-85	9웰 접시라고도 합니다.
유리 커버 슬립 (22 x 22 mm)	피셔 사이언티픽	12-542-B
유리 현미경 슬라이드(25 x 75 x 1mm)	피셔 사이언티픽	제12-550-413
유리 페트리 접시	코 닝	3160-100보
글리세롤	시그마-알드리치	G5516
마이크로 원심분리기 튜브	액시겐	MCT-175-C
미해부 가위	정밀 과학 도구	15000-03
마이크로웰 트레이(72 x 10 μL 웰)	눕크	438733
마운팅 미디어			PBS에 0.5% N-프로필갈레이트 및 80% 글리세롤
N-프로필갈레이트	시그마-알드리치	P3130
PBS(인산염 완충 식염수 pH 7.4)	시그마-알드리치	P5368	제조업체의 지침에 따라 준비하십시오.
증권 시세			PBS의 0.15% TritonX 및 0.5% 소 혈청 알부민, pH 7.4
핀 홀더	정밀 과학 도구	26016-12
1차 항체: goat anti-GAPDH	이제넥스	IMG-3073	웨스턴 블로팅용. 1:3000에 사용됨
1차 항체: rabbit anti-cleaved Dcp-1	세포 신호 전달	9578초	면역 형광용. 1:100에 사용됨
1차 항체: rat anti-DEcad	발달 연구 Hybridoma Bank	디케이드2	면역 형광용. 1:20에 사용됨
1차 항체: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	디케이드1	우에무라 타다시의 선물. 1:100에 사용됩니다.
메스 블레이드	정밀 과학 도구	10050	스케이프 블레이드의 작은 조각을 부수고 블레이드 홀더에 고정합니다.
2차 항체: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	전화: 712-545-153	면역 형광용. 1:200에 사용됨
2차 항체: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 111-165-144	면역 형광용. 1:100에 사용됨
2차 항체: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	세포 신호 전달 기술	7077	웨스턴 블로팅용. 1:3000에 사용됨
2차 항체: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 305-035-003	웨스턴 블로팅용. 1:3000에 사용됨
실체 해부 현미경(M60 또는 M80)	라이카 마이크로시스템즈		또는 유사한 현미경
실가드 (블랙)	다우코닝	SYLG170
실가드 (투명)	다우코닝	SYLG184	곱게 빻은 숯불 가루가 있는 검정색
조직: Kimwipes	(주)킴텍	34120
트리톤X	시그마-알드리치	T8787
텅스텐 바늘, 미세	정밀 과학 도구	10130-10	핀 홀더에 삽입
텅스텐 바늘, 견고함	정밀 과학 도구	10130-20	핀 홀더에 삽입
효모 페이스트	(현지 슈퍼마켓)		~2mL 증류된 H2O에 용해된 Fleischmann의 ActiveDry 효모(또는 이와 유사한 것) 약 2테이블스푼