초파리 Late Pupa IFM(Indirect Flight Muscle) 해부: 고처리량 조직 수집 방법

초록

출처: Kao, S. Y., et al. 오믹스 접근법을 위한 초파리 멜라노가스터 비행 근육 해부. J. Vis. 특급 (2019).

초파리 비행 근육은 근육 발달 및 생리학을 위한 모델 시스템으로 사용됩니다. 이 비디오는 성인의 비행 근육 조직에 대해 설명하고 번데기의 RNA 염기서열 분석에 적합한 간접 비행 근육 발달을 해부하는 프로토콜을 강조합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌

한 것입니다.

1. 48시간 APF 후 IFM 해부

1. 2개의 #5 생물학 등급 겸자, 미세 가위, 표준 유리 현미경 슬라이드, 양면 테이프, 피펫, 피펫 팁, 드라이아이스 및 분리 시약(RNA 응용 분야의 경우)을 포함한 필수 장비를 조립합니다(재료 표 참조). 1x PBS와 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음에 올려 식힙니다.
2. 살짝 적신 붓을 사용하여 단계적 인 번데기를 현미경 슬라이드에 장착 된 양면 접착 테이프 스트립으로 옮깁니다 (그림 1A). 번데기를 같은 방향(배쪽이 아래쪽이고 앞쪽이 슬라이드 아래쪽을 향함)으로 일렬로 놓습니다.
   참고: 붓이나 필터에 물을 너무 많이 사용하면 번데기가 잘 달라붙지 않도록 주의하세요. 번데기가 달라붙지 않으면 먼저 마른 필터나 티슈 페이퍼에 옮겨 말리십시오. 30분 이내에 해부할 수 있는 한 많은 번데기를 장착하는 것이 좋으며, 이상적으로는 ~10마리의 번데기를 장착하십시오.
3. 번데기 케이스에서 번데기를 꺼냅니다. 집게를 사용하여 앞쪽 첨탑 위의 번데기를 떼어내고 엽니다(그림 1B).
4. 한 쌍의 집게를 뒤쪽으로 부드럽게 밀어 집게가 움직일 때 번데기를 자릅니다(그림 1B'). 밑에 있는 번데기가 파열되지 않도록 주의하세요. 열린 케이스에서 번데기를 꺼내고 즉시 두 번째 현미경 슬라이드(그림 1 B",C)에서 1x PBS 한 방울로 옮깁니다.
5. 줄에 있는 모든 번데기에 대해 1.3단계와 1.4단계를 반복한 다음 양면 테이프 슬라이드를 따로 보관합니다.
6. 가는 가위를 사용하여 번데기의 복부를 흉부에서 잘라 별도의 더미로 밀어 넣습니다(그림 1D,D'). 나머지 번데기에 대해 반복합니다.
   참고: 번데기의 무결성이 중단되는 즉시 1.6단계로 해부 길이를 측정하기 시작합니다. 세포 사멸 및 관련 전사체 및 단백질체 변화를 방지하기 위해 20-30분 내에 가능한 한 많은 파리를 해부합니다. 1 d 성체 또는 >90 h 번데기를 해부 할 때 나중 단계에서 가위 가위로 머리를 추가로 제거하는 것이 편리합니다.
7. 티슈 페이퍼를 사용하여 1x PBS(일반적으로 부유 지방이 있는 흐림)와 복부 더미(그림 1E)의 대부분을 제거합니다. 남은 흉부에 신선하고 차갑게 식힌 1x PBS 한 방울을 떨어뜨립니다.
8. 가위를 사용하여 머리에서 세로 몸체 축을 따라 한 번의 동작으로 절단하여 흉부를 반으로 자릅니다(그림 1F,F'). 또는 머리가 제거된 경우 먼저 머리가 부착된 곳에 가위를 삽입하고 IFM 사이에 흉부의 위쪽 절반을 세로로 자릅니다. 그런 다음 같은 방향으로 두 번째 절단으로 흉부의 복부 쪽을 자릅니다.
9. 해부할 모든 번데기에 대해 1.7단계와 1.8단계를 반복하여 슬라이드 중앙 근처에 흉부 반쪽 절개 더미를 생성합니다. 반부분이 마르지 않도록 슬라이드에 냉각된 1x PBS가 충분히 있는지 확인하십시오.
   참고: 48시간 APF 후 IFM은 표준 해부 현미경으로 훈련된 눈으로 볼 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 프로토콜의 이 시점에서 형광 라벨이 있는 근육을 형광 해부 내시경으로 이동하여 IFM 식별을 돕거나 훈련 목적으로 사용할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
10. 흉부에서 IFM을 해부합니다. #5 집게(그림 1, G,H)를 사용하여 반단면 중 하나를 분리합니다. IFM의 중간 위와 아래에 집게의 끝을 부드럽게 삽입합니다(그림 1G',H'). 첫 번째 집게를 움직이지 않은 상태에서 가는 가위를 사용하여 IFM의 한쪽 끝을 큐티클과 힘줄에서 잘라냅니다. 그런 다음 IFM의 다른 쪽 끝을 큐티클에서 제거합니다(그림 1G'',H'').
    참고: 첫 번째 IFM 절단 후 흉부의 방향에 따라 두 번째 IFM 절단을 더 쉽게 수행할 수 있도록 흉부를 180° 회전하는 것이 유용합니다.
11. 집게(그림 1G''',H''')로 흉부에서 IFM 번들을 제거하고 PBS 버블의 가장자리로 옮겨 물 장력을 사용하여 제자리에 고정합니다(그림 1I). 시체를 슬라이드의 반대쪽으로 밉니다. 나머지 흉부 반부분에 대해 반복하여 절개된 IFM의 컬렉션을 생성합니다.
    참고: IFM이 깔끔하게 쌓이지 않으면 티슈로 1x PBS 중 일부를 제거합니다. 모든 PBS가 증발하지 않도록 주의하고 절개된 IFM과 반흉부가 완충액으로 덮여 있는지 확인하십시오.
12. 모든 IFM을 해부한 후 절개된 근육에 대한 품질 관리를 신속하게 수행합니다. #5 집게를 사용하여 샘플에 들어갔을 수 있는 점프 근육 또는 큐티클 조각을 제거합니다(그림 1J-K'').
    참고: 점프 근육은 IFM과 다르게 나타납니다. 형광 하에서 Mef2-Gal4 표지 근육을 해부하면 점프 근육은 형광이 약하고 모양과 질감이 다릅니다. 정상적인 빛에서는 IFM이 불투명한 유백색(그림 1J-J'',K)인 반면 거의 반투명하게 보입니다.
13. 물 장력을 사용하여 한 쌍의 집게(그림 1 L) 사이에서 절개된 IFM을 캡처합니다(찌그러뜨리지 않음). IFM을 250μL의 냉각된 1x PBS(그림 1M)가 미리 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 섹션 2.
    를 즉시 진행하십시오. 참고: 집게 끝을 서로 가까이 놓고 완충 용액에서 들어 올리면 물 장력으로 인해 집게 끝 사이에 완충 기포가 포획됩니다. IFM이 이 버블에도 존재하는 경우 용액에서 들어 올려 다른 완충액으로 채워진 용기로 쉽게 옮길 수 있습니다. 완충 기포에 포집된 조직이 침식되는 것을 방지하기 위해 집게를 쥐어 끝이 서로 닿지 않도록 서로 가까이 가져오는 것이 중요합니다.

2. IFM 샘플 펠릿 및 보존

1. 탁상용 원심분리기에서 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 2,000 x g에서 3-5분 동안 원심분리하여 IFM을 펠릿화합니다(그림 2A,B).
2. 피펫 팁(그림 2 C)을 사용하여 버퍼를 제거합니다.
3. RNA 응용 분야의 경우 원하는 RNA 분리 완충액의 50–100 μL에 IFM 펠릿을 재현탁합니다(재료 표 그림 2D 참조). 그렇지 않으면 2.4.
   단계로 진행합니다. 참고: IFM은 질량 분석법 준비 또는 상용 키트로 RNA 분리를 위해 2.2단계 후에 건조 동결할 수 있습니다(대표 결과 참조). RNA 응용 분야의 경우, IFM 펠릿을 분리 완충액에서 즉시 재현탁 및 동결하여 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
4. 드라이 아이스에 샘플을 동결하거나 액체 질소 (그림 2E)에서 동결합니다. 다운스트림 분석을 위한 시료 전처리의 후속 단계가 준비될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 냉동 보존 후 시료는 다운스트림 조사를 위해 처리하기 전에 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다.

결과

그림 1: 48시간 APF 후 IFM 해부. (A) 양면 테이프에 번데기를 정렬합니다. (B) 번데기 케이스에서 번데기를 앞쪽으로 열고, 케이스를 등쪽으로 자르고(B'), 번데기를 들어 올려 번데기를 꺼냅니다(B''). 원 기호는 그림 2와 동일하게 표시되었습니다. (C) 번데기를 완충기로 옮기는 것. (D) 가위로 절단하여 복부를 제거하고(노란색 이중 화살표) 흉부에서 분리(D'). (E,F) 깨끗한 완충액(E)을 추가한 다음 흉부를 세로로 반으로 자릅니다...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60mm 배양 접시	시그마-알드리치	Z643084-600개	Greiner 접시, 60mm x 15mM, 통풍구
휴대 전화 카메라, 삼성 갤럭시 S9	삼성	SM-G960F/DS	현미경으로 촬영하지 않은 사진에 사용됩니다.
더블 스틱 테이프	스카치/3M	3M ID 70005108587	대부분의 사무용품 취급자에서 사용할 수 있는 양면 테이프
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11252-20	Inox 스트레이트 팁 11cm 집게, 0.05mm x 0.02mm 팁의 생물학 등급
형광 해부 현미경 카메라, Leica DFC310 FX 카메라	라이카		www.leica-microsystems.com
형광 해부 현미경 소프트웨어, Leica Application Suite(LAS) 버전 4.0.0	라이카		www.leica-microsystems.com
형광 해부 현미경, Leica M165 FC	라이카		www.leica-microsystems.com
플라이 : Bru1 [M2]			플라이 스톡; 본 논문
플라이 : Bru1 [M3]			플라이 스톡; 본 논문
플라이 : MEF2-GAL4	블루밍턴 스톡 센터	BDSC:27390	플라이 스톡
파리: salm[1]	블루밍턴 스톡 센터	3274	플라이 스톡
플라이 : salm [FRT]			플라이 스톡; Spletter et al., Elife, 2018 참조
비행: UAS-Bru1IR	비엔나 초파리 연구 센터	GD41568	플라이 스톡, RNAi 헤어핀
비행거리: UAS-GFP::Gma	블루밍턴 스톡 센터	BDSC:31776	플라이 스톡
비행: UAS-mCD8a::GFP	블루밍턴 스톡 센터	BDSC : 5130	플라이 스톡
파리: w[1118]	블루밍턴 스톡 센터	3605	플라이 스톡
파리: weeP26			플라이 스톡; Clyne et al., Genetics, 2003 참조
GFP 검출 시약, GFP-Booster	크로모텍	GBA488-100
글리코겐	인비트로젠	제10814-010
이미지 처리 소프트웨어, Photoshop CS6	어도비		www.adobe.com
이소프로파놀	시그마-알드리치	I9516-25ML	2- 프로판올
방법 1(RNA 분리): TRIzol	생명 기술	15596018	Guanidinium isothiocyanate 및 phenol monophasic solution
방법 2 (RNA 분리): 방법 1 + TURBO DNA-free 키트	인비트로젠	AM1907	TRIzol 분리 후 DNA를 제거하는 키트로 처리
방법 3(RNA 분리): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	자이모 리서치	R2070S	TRIzol에서 RNA 분리, 그러나 상 분리를 사용하는 대신 상용 컬럼을 통해. Monarch DNase I 반응 완충액에서 Monarch Dnase I으로 수행된 권장 DNase 처리.
방법 4(RNA 분리): RNeasy Plus Mini Kit	키아겐	74134	제공된 DNase 처리를 사용했습니다. IFM 펠릿은 동물 조직에 대해 제안된 바와 같이 RTL 완충액에서 균질화되었습니다.
방법 5(RNA 분리): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep 시스템	프로메가	Z6110	'Purification of RNA from Fibrous Tissues'를 위한 프로토콜을 적용하였습니다.
방법 6(RNA 분리): Monarch Total RNA Miniprep Kit	뉴잉글랜드 바이오랩스	T2010G	조직/백혈구에 프로토콜을 적용하고 300μL의 RNA 보호 시약에서 용해시켰습니다.
마이크로 원심분리기 튜브	써모 피셔	AM12400	RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5 mL
현미경 슬라이드	써모 피셔	12342108	표준 슬라이드, 비충전, 1mm
화필	마라부	1910000000	Marabu Fino Round No. 0 또는 모든 미술품 공급품의 유사한 브러시
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127
PBS 버퍼(1x)	시그마-알드리치	P4417	1L 용액용 인산염 완충 식염수 정제, pH 7.4
PFA PureTip 피펫 팁	엘리멘탈 사이언티픽	ES-7000-0101	시료 손실을 줄이기 위해 표준 피펫 팁을 대체할 수 있는 옵션; 100 mL, 0.8 mm 오리피스
피펫 팁	시그마-알드리치	P5161	범용 200 mL 피펫 팁
RNA 농도 접근법 1 및 RNA 무결성 추적, 바이오분석기	애질런트 테크놀로지스	G2939BA
RNA 농도 접근법 2, Nanodrop	써모 피셔	ND-2000
RNA 농도 접근법 3, Qubit 4 형광측정기	인비트로젠	Q33238
RNase A	프로메가	A7937
RNase가 없는 물, 디에틸 피로카보네이트(DEPC)	시그마-알드리치	D5758	DEPC는 밤새 물을 처리한 다음 오토클레이브하여 모든 RNase를 제거합니다.
RT 키트 #1: Super Script III 역전사 효소 키트	인비트로젠	제18080-044	역전사 키트
RT 키트 #2: 루나스크립트	뉴잉글랜드 바이오랩스	E3010에스	역전사 키트
RT 키트 #3: QuantiNova 역전사 키트	키아겐	제205410	역전사 키트
통계 소프트웨어: GraphPad Prism	GraphPad 프리즘		www.graphpad.com
통계 소프트웨어: Microscoft Excel	마이크로소프트		번들의 일부로 구매: Office Home & Student 2019
탁상용 원심분리기	에펜도르프	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 또는 동급 제품
티슈/킴와이프	시그마-알드리치	Z188956	표준 티슈 물티슈
이송 피펫	시그마-알드리치	Z350796	플라스틱 피펫
Vannas 스프링 가위	정밀 과학 도구	15000-00	절삭날 3mm, 팁 직경 0.05mm, 길이 8cm
Whatman 종이	시그마-알드리치	제1004-070	여과지 원형, 4등급, 70mm

년 년 년 호 (영문) 년 호 호 년 호