초파리 Late Pupa IFM(Indirect Flight Muscle) 해부: 고처리량 조직 수집 방법

초록

출처: Kao, S. Y., et al. 오믹스 접근법을 위한 초파리 멜라노가스터 비행 근육 해부. J. Vis. 특급 (2019).

초파리 비행 근육은 근육 발달 및 생리학을 위한 모델 시스템으로 사용됩니다. 이 비디오는 성인의 비행 근육 조직에 대해 설명하고 번데기의 RNA 염기서열 분석에 적합한 간접 비행 근육 발달을 해부하는 프로토콜을 강조합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌

한 것입니다.

1. 48시간 APF 후 IFM 해부

1. 2개의 #5 생물학 등급 겸자, 미세 가위, 표준 유리 현미경 슬라이드, 양면 테이프, 피펫, 피펫 팁, 드라이아이스 및 분리 시약(RNA 응용 분야의 경우)을 포함한 필수 장비를 조립합니다(재료 표 참조). 1x PBS와 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음에 올려 식힙니다.
2. 살짝 적신 붓을 사용하여 단계적 인 번데기를 현미경 슬라이드에 장착 된 양면 접착 테이프 스트립으로 옮깁니다 (그림 1A). 번데기를 같은 방향(배쪽이 아래쪽이고 앞쪽이 슬라이드 아래쪽을 향함)으로 일렬로 놓습니다.
   참고: 붓이나 필터에 물을 너무 많이 사용하면 번데기가 잘 달라붙지 않도록 주의하세요. 번데기가 달라붙지 않으면 먼저 마른 필터나 티....

결과

그림 1: 48시간 APF 후 IFM 해부. (A) 양면 테이프에 번데기를 정렬합니다. (B) 번데기 케이스에서 번데기를 앞쪽으로 열고, 케이스를 등쪽으로 자르고(B'), 번데기를 들어 올려 번데기를 꺼냅니다(B''). 원 기호는 그림 2와 동일하게 표시되었습니다. (C) 번데기를 완충기로 옮기는 것. (D) 가위로 절단하여 복부를 제거하고(노란색 이중 화살표) 흉부에서 분리(D'). (E,F) 깨끗한 완충액(E)을 추가한 다음 흉부를 세로로 반으로 자릅니다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60mm 배양 접시	시그마-알드리치	Z643084-600개	Greiner 접시, 60mm x 15mM, 통풍구
휴대 전화 카메라, 삼성 갤럭시 S9	삼성	SM-G960F/DS	현미경으로 촬영하지 않은 사진에 사용됩니다.
더블 스틱 테이프	스카치/3M	3M ID 70005108587	대부분의 사무용품 취급자에서 사용할 수 있는 양면 테이프
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11252-20	Inox 스트레이트 팁 11cm 집게, 0.05mm x 0.02mm 팁의 생물학 등급
형광 해부 현미경 카메라, Leica DFC310 FX 카메라	라이카		www.leica-microsystems.com
형광 해부 현미경 소프트웨어, Leica Application Suite(LAS) 버전 4.0.0	라이카		www.leica-microsystems.com
형광 해부 현미경, Leica M165 FC	라이카		www.leica-microsystems.com
플라이 : Bru1 [M2]			플라이 스톡; 본 논문
플라이 : Bru1 [M3]			플라이 스톡; 본 논문
플라이 : MEF2-GAL4	블루밍턴 스톡 센터	BDSC:27390	플라이 스톡
파리: salm[1]	블루밍턴 스톡 센터	3274	플라이 스톡
플라이 : salm [FRT]			플라이 스톡; Spletter et al., Elife, 2018 참조
비행: UAS-Bru1IR	비엔나 초파리 연구 센터	GD41568	플라이 스톡, RNAi 헤어핀
비행거리: UAS-GFP::Gma	블루밍턴 스톡 센터	BDSC:31776	플라이 스톡
비행: UAS-mCD8a::GFP	블루밍턴 스톡 센터	BDSC : 5130	플라이 스톡
파리: w[1118]	블루밍턴 스톡 센터	3605	플라이 스톡
파리: weeP26			플라이 스톡; Clyne et al., Genetics, 2003 참조
GFP 검출 시약, GFP-Booster	크로모텍	GBA488-100
글리코겐	인비트로젠	제10814-010
이미지 처리 소프트웨어, Photoshop CS6	어도비		www.adobe.com
이소프로파놀	시그마-알드리치	I9516-25ML	2- 프로판올
방법 1(RNA 분리): TRIzol	생명 기술	15596018	Guanidinium isothiocyanate 및 phenol monophasic solution
방법 2 (RNA 분리): 방법 1 + TURBO DNA-free 키트	인비트로젠	AM1907	TRIzol 분리 후 DNA를 제거하는 키트로 처리
방법 3(RNA 분리): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	자이모 리서치	R2070S	TRIzol에서 RNA 분리, 그러나 상 분리를 사용하는 대신 상용 컬럼을 통해. Monarch DNase I 반응 완충액에서 Monarch Dnase I으로 수행된 권장 DNase 처리.
방법 4(RNA 분리): RNeasy Plus Mini Kit	키아겐	74134	제공된 DNase 처리를 사용했습니다. IFM 펠릿은 동물 조직에 대해 제안된 바와 같이 RTL 완충액에서 균질화되었습니다.
방법 5(RNA 분리): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep 시스템	프로메가	Z6110	'Purification of RNA from Fibrous Tissues'를 위한 프로토콜을 적용하였습니다.
방법 6(RNA 분리): Monarch Total RNA Miniprep Kit	뉴잉글랜드 바이오랩스	T2010G	조직/백혈구에 프로토콜을 적용하고 300μL의 RNA 보호 시약에서 용해시켰습니다.
마이크로 원심분리기 튜브	써모 피셔	AM12400	RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5 mL
현미경 슬라이드	써모 피셔	12342108	표준 슬라이드, 비충전, 1mm
화필	마라부	1910000000	Marabu Fino Round No. 0 또는 모든 미술품 공급품의 유사한 브러시
파라포름알데히드	시그마-알드리치	158127
PBS 버퍼(1x)	시그마-알드리치	P4417	1L 용액용 인산염 완충 식염수 정제, pH 7.4
PFA PureTip 피펫 팁	엘리멘탈 사이언티픽	ES-7000-0101	시료 손실을 줄이기 위해 표준 피펫 팁을 대체할 수 있는 옵션; 100 mL, 0.8 mm 오리피스
피펫 팁	시그마-알드리치	P5161	범용 200 mL 피펫 팁
RNA 농도 접근법 1 및 RNA 무결성 추적, 바이오분석기	애질런트 테크놀로지스	G2939BA
RNA 농도 접근법 2, Nanodrop	써모 피셔	ND-2000
RNA 농도 접근법 3, Qubit 4 형광측정기	인비트로젠	Q33238
RNase A	프로메가	A7937
RNase가 없는 물, 디에틸 피로카보네이트(DEPC)	시그마-알드리치	D5758	DEPC는 밤새 물을 처리한 다음 오토클레이브하여 모든 RNase를 제거합니다.
RT 키트 #1: Super Script III 역전사 효소 키트	인비트로젠	제18080-044	역전사 키트
RT 키트 #2: 루나스크립트	뉴잉글랜드 바이오랩스	E3010에스	역전사 키트
RT 키트 #3: QuantiNova 역전사 키트	키아겐	제205410	역전사 키트
통계 소프트웨어: GraphPad Prism	GraphPad 프리즘		www.graphpad.com
통계 소프트웨어: Microscoft Excel	마이크로소프트		번들의 일부로 구매: Office Home & Student 2019
탁상용 원심분리기	에펜도르프	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 또는 동급 제품
티슈/킴와이프	시그마-알드리치	Z188956	표준 티슈 물티슈
이송 피펫	시그마-알드리치	Z350796	플라스틱 피펫
Vannas 스프링 가위	정밀 과학 도구	15000-00	절삭날 3mm, 팁 직경 0.05mm, 길이 8cm
Whatman 종이	시그마-알드리치	제1004-070	여과지 원형, 4등급, 70mm

년 년 년 호 (영문) 년 호 호 년 호