초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 프로토콜은 Hancock et al., In vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).

1. 생체 내 칼슘 이미징

1. 적외선 레이저와 침수 대물렌즈(재료 표 참조)가 장착된 다광자 현미경을 진동 차단 테이블에 설치하여 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지시약의 시각화를 위해 레이저를 920nm의 여기 파장으로 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다.
2. 거친 Z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 Z축을 스캔하고 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 기능을 사용하면 이 영역에만 스캔을 집중시켜 스캔 시간을 최소화하고, 머리 앞쪽이 아래를 향하도록 스캔 보기를 회전
할 수 있습니다.
3. 프레임 크기를 512 x 512픽셀로, 스캔 속도를 > 4Hz로, 스캔 영역(Y 차원)을 조정하여 관심 있는 뉴런이 덮이도록 합니다.

2. 후각 조건화를 통한 냄새 유발 칼슘 과도현상의 시각화

1. 시간적으로 정확한 방식으로 여러 냄새 자극을 전달할 수 있는 냄새 전달 시스템을 사용하십시오.
   1. 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중 이미지 캡처와 냄새 자극을 조정합니다.
   2. 별도의 프로그램에서 냄새 전달 프로토콜의 시작에 의해 제공되는 외부 입력 트리거에 응답하는 이미지 획득 소프트웨어와 냄새 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 재료 표 참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작합니다.
2. 512 x 512 px의 해상도와 4Hz의 프레임 속도에서 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도 현상을 모니터링하여 측정을 시작합니다. 냄새 시작 전 6.25초(F₀ 기준선 값 설정 위해) 및 냄새 상쇄 후 12.5초 동안 추가 이미지 획득으로 2.5초의 냄새 자극을 제공합니다. 두 번째 냄새 맡는 제로, 세 번째 취하기로 이 과정을 반복하십시오.
3. 이 측정 후 3분 동안 플라이에 대한 고전적 조건화("훈련")를 계속합니다.
   1. "사전 교육" 단계에서 제시된 냄새 중 하나를 선택하여 CS⁺ 냄새가 되도록 하고 다른 하나를 선택하여 CS^- 냄새가 되도록 합니다. 12개의 90V 전기 충격과 함께 60초 동안 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 CS⁺ 냄새를 표시합니다.
   2. 60초 휴식 후 60초 동안 CS^- 냄새만 나타냅니다. 4-메틸시클로헥산올 및 3-옥탄올 냄새로 사용합니다. 세 번째 냄새 물질(예: 1-octen-3-ol)은 교육 단계 전(2.2단계)과 이후(2.4단계)에만 대조군으로 사용되므로 이 교육 중에는 제시하지 마십시오.
4. 훈련 단계(2.3단계)를 마친 후 3분 후에 "훈련 전" 냄새 자극 프로토콜(2.2단계)을 반복하여 "훈련 후" 냄새가 유발하는 칼슘 과도 현상을 다시 측정합니다.
   참고: 이 단계의 타이밍은 기억 형성 후 관심 시간을 반영해야 합니다(예: 단기 기억을 조사하기 위해 조건화 단계 3-4분 후에 이 단계 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 생존할 수 있습니다.
5. 나중에 이미지 분석을 위해 이미징 파일을 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장합니다.