초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

초록

출처: Hancock, C. E., et al. Drosophila melanogaster에서 학습 유도 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Hancock et al., In vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).

1. 생체 내 칼슘 이미징

1. 적외선 레이저와 침수 대물렌즈(재료 표 참조)가 장착된 다광자 현미경을 진동 차단 테이블에 설치하여 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지시약의 시각화를 위해 레이저를 920nm의 여기 파장으로 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다.
2. 거친 Z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 Z축을 스캔하고 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 기능을 사용하면 이 영역에만 스캔을 집중시켜 스캔 시간을 최소화하고, 머리 앞쪽이 아래를 향하도록 스캔 보기를 회전
할 수 있습니다.
3. 프레임 크기를 512 x 512픽셀로, 스캔 속도를 > 4Hz로, 스캔 영역(Y 차원)을 조정하여 관심 있는 뉴런이 덮이도록 합니다.

2. 후각 조건화를 통한 냄새 유발 칼슘 과도현상의 시각화

1. 시간적으로 정확한 방식으로 여러 냄새 자극을 전달할 수 있는 냄새 전달 시스템을 사용하십시오.
   1. 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중 이미지 캡처와 냄새 자극을 조정합니다.
   2. 별도의 프로그램에서 냄새 전달 프로토콜의 시작에 의해 제공되는 외부 입력 트리거에 응답하는 이미지 획득 소프트웨어와 냄새 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 재료 표 참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작합니다.
2. 512 x 512 px의 해상도와 4Hz의 프레임 속도에서 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도 현상을 모니터링하여 측정을 시작합니다. 냄새 시작 전 6.25초(F₀ 기준선 값 설정 위해) 및 냄새 상쇄 후 12.5초 동안 추가 이미지 획득으로 2.5초의 냄새 자극을 제공합니다. 두 번째 냄새 맡는 제로, 세 번째 취하기로 이 과정을 반복하십시오.
3. 이 측정 후 3분 동안 플라이에 대한 고전적 조건화("훈련")를 계속합니다.
   1. "사전 교육" 단계에서 제시된 냄새 중 하나를 선택하여 CS⁺ 냄새가 되도록 하고 다른 하나를 선택하여 CS^- 냄새가 되도록 합니다. 12개의 90V 전기 충격과 함께 60초 동안 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 CS⁺ 냄새를 표시합니다.
   2. 60초 휴식 후 60초 동안 CS^- 냄새만 나타냅니다. 4-메틸시클로헥산올 및 3-옥탄올 냄새로 사용합니다. 세 번째 냄새 물질(예: 1-octen-3-ol)은 교육 단계 전(2.2단계)과 이후(2.4단계)에만 대조군으로 사용되므로 이 교육 중에는 제시하지 마십시오.
4. 훈련 단계(2.3단계)를 마친 후 3분 후에 "훈련 전" 냄새 자극 프로토콜(2.2단계)을 반복하여 "훈련 후" 냄새가 유발하는 칼슘 과도 현상을 다시 측정합니다.
   참고: 이 단계의 타이밍은 기억 형성 후 관심 시간을 반영해야 합니다(예: 단기 기억을 조사하기 위해 조건화 단계 3-4분 후에 이 단계 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 생존할 수 있습니다.
5. 나중에 이미지 분석을 위해 이미징 파일을 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 옥텐 3 ol	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	O5284	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
3-옥탄올	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	218405	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
4-메틸시클로헥산올	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	153095	냄새 물질로 사용되는 화학 물질
EGFP용 대역통과 필터(525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나
미네랄 오일	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	M8410	부취제의 희석제로 사용
모드 잠금 Ti-사파이어 레이저 카멜레온 비전 2	Coherent Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라		조정 가능한 적외선 펨토초 레이저
BiG 검출기가 장착된 다광자 현미경 LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나		다광자 현미경, 여러 회사에서 유사한 장치를 제공합니다.
Plan-Apochromat 20x(NA = 1.0) 수침 대물렌즈	Carl Zeiss Microscopy GmbH, 독일 예나	421452-9900-000	대물렌즈 W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
냄새 전달 장치 및 전기 충격 응용 장치(전원 공급 장치)에서 트리거를 수신하여 현미경을 제어하는 Zeiss의 ZEN 소프트웨어와 상호 작용하는 VBA(Visual Basics of Applicatons) 소프트웨어	주문 제작되고 요청시 이용 가능	북미	북미