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이 프로토콜은 Gervaise and Arur, C. elegans 생식선에서 활성 ERK의 공간 및 시간 분석. J. Vis. 특급.(2016).
1. 생식선을 얻기 위한 성충 해부
- 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 100 μL의 M9 버퍼에서 원하는 특정 발달 단계(L1, L2, L3, L4, 성인 등)에서 100 - 150 WT(N2) 또는 원하는 유전자형을 선택합니다.
- 마이크로 원심분리기 튜브에 900μL의 M9 버퍼를 채웁니다(재료 표 참조). 마이크로 원심분리기에서 1,000 x g의 튜브를 주변 온도에서 1분 동안 원심분리합니다.
- M9 버퍼의 900μL를 부드럽게 제거하고 버립니다. 해부 현미경으로 완충액을 제거하여 벌레가 실수로 제거되지 않도록 합니다.
- 매번 새로운 M9 버퍼를 사용하여 1.2 - 1.3단계를 두 번 더 반복합니다. 이렇게 하면 기생충과 함께 운반된 모든 박테리아가 효과적으로 씻겨 나갈 수 있습니다.
- 최종 세척 후 튜브에서 900μL의 M9 버퍼를 제거하고 폐기합니다.
- 200 μL-마이크로피펫 팁이 있는 100 - 150 웜이 들어 있는 나머지 100 μL의 M9 버퍼를 평평한 바닥 유리 시계 접시에 옮깁니다. 사용하기 전에 마이크로피펫 팁이 10μL 표시에서 절단되었는지 확인하십시오. 팁을 자르지 않으면 웜이 깎일 수 있습니다.
- 1 - 3 μL의 0.1 M 레바미솔을 M9 완충액의 벌레가 들어있는 유리 시계 접시에 추가합니다. 레바미솔과 M9를 부드럽게 휘젓면 벌레가 움직임을 멈출 때까지 균일하게 혼합할 수 있습니다.
참고: Levamisole 재고는 장기 보관을 위해 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 여기서, 동물의 급격한 이동성 상실을 얻기 위해 0.2 - 0.25 mM의 레바미솔에 대한 문헌23에 기술된 것보다 더 높은 농도의 1 - 3 mM를 사용하십시오. 동물이 액체 현탁액에서 너무 오랫동안 주변을 돌아다니면 생식선에서 dpERK의 결과 패턴이 다양할 수 있습니다(스트레스나 영양 부족 또는 둘 다로 인해). 해부를 위해 1 - 3 mM 레바미솔로 더 재현성 있는 염색 패턴이 달성되었습니다.
- 2개의 1mL 주사기에 2개의 25G 바늘을 부착합니다(주사기의 크기는 중요하지 않으며 바늘의 게이지가 중요합니다). 양손에 주사기를 하나씩 놓습니다(그림 1).
- 해부 현미경으로 그림 1과 같이 각 바늘을 각 웜 아래와 위에 놓고 가위와 같은 동작으로 두 번째 인두구 근처의 웜을 미세하게 자릅니다. 지렁이를 한 번 자른 후 접시에 있는 모든 동물이 한 번 이상 자른 때까지 다음 동물로 이동합니다.
참고: 1.8 - 1.9단계는 시간에 민감합니다. 재현 가능한 dpERK 패턴을 위해 5분 이내에 접시에 있는 모든 벌레를 해부합니다. 해부 시간이 길면 특히 Zone 1에서 dpERK 신호가 꺼집니다. 할당된 시간 프레임을 유지하기 위해 필요한 경우 해부 라운드당 웜 수를 조정합니다(즉, 50마리 대 150마리).
- 해부 중에 돌출된 생식선이 보이지 않는 경우 동일한 동물에서 다른 절단을 시도하지 마십시오. 일반적으로 그것은 동물을 깎을 뿐이고 생식선의 압출을 초래하지 않습니다. 대신 다음 동물로 이동합니다. 생식선이 돌출되지 않는 웜은 섹션 6에서 만들 슬라이드에 그대로 나타나며 이미징 중에는 무시할 수 있습니다
참고: 모든 해부 및 처리 단계를 통해 생식선은 시체/사체에 부착된 상태로 유지된다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 바늘로 생식선과 몸을 억지로 분리하지 마십시오. 종종 몸에서 생식선을 절단하려고 시도하기 위해 생식선 조직이 비정상적으로 찢어지면 가짜 항체 신호가 발생할 수 있습니다. 이미징 단계에서 시체/사체는 무시할 수 있으며 생식선만 이미징할 수 있습니다. 또한, 때때로 장 세포는 분석 중인 항체에 대한 내부 대조군/체세포 대조군 역할도 할 수 있습니다.
그림 1: 해부 중 바늘 위치 시연. 왼쪽: 해부 진행 중인 사진. 오른쪽: 웜을 참조한 바늘 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
