Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

초록

출처: Prior, H., et al. CRISPR/Cas9 리보핵단백질을 사용하여 예쁜꼬마선충에서 게놈 점 돌연변이를 생성하기 위한 빠르고 용이한 파이프라인.J. Vis. 특급(2018).

이 비디오는 PCR 스크리닝을 통해 단일 선충에서 유전자 마커를 빠르게 스크리닝하는 기술을 설명합니다. 예시 프로토콜에서는 CRISPR 기반 게놈 편집을 스크리닝합니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌

한 것입니다.

단일 웜 PCR 및 유전형 분석

알을 낳은 지
1. 1-2일 후, 웜 픽을 사용하여_F1s를 7 μL의 웜 용해 버퍼가 들어 있는 개별 PCR 스트립 튜브 캡으로 옮깁니다(표 1, 그림 1D, 4-5일).
2. 실온에서 1분 동안 최대 속도로 원심분리기 PCR 튜브를 사용하여 동물을 튜브 바닥으로 가져오고 -80°C에서 1시간 동안 튜브를 동결<> 참고: 벌레는 -80 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다.
3. 다음 프로그램을 사용하여 열순환기에서 얼어붙은 웜을 용해시킵니다: 60°C 동안 60분, 95°C에서 15분, 4°C 유지.
4. PCR 마스터믹스를 표 2와 같이 설정합니다.
5. 21μL의 PCR 마스터믹스를 깨끗한 PCR 튜브에 첨가한 다음 3단계에서 4μL의 웜 용해를 추가합니다. 피펫을 사용하여 잘 혼합하고 제조업체 지침에 따라 PCR 프로그램을 실행합니다(재료 표 참조).
6. 제조업체 지침에 따라 DNA Clean and Concentrate 키트를 사용하여 PCR 반응을 정제합니다(재료 표 참조). 스핀 컬럼에 10μL의 물을 첨가하여 DNA를 용리합니다.
7. 표 3에 나타난 바와 같이 설정 제한 효소 마스터믹스.
8. 세척된 각 PCR 반응에 10 μL의 제한 효소 마스터믹스를 추가하고 37 °C에서 1 - 2 시간 동안 배양합니다.
9. 1x Tris-acetate-EDTA(TAE) 완충액을 사용하여 120V에서 실행되는 1.5% 아가로스 겔에서 분해된 PCR 산물을 분리합니다.

결과

그림 1. C. eleganssod-1 유전자 자리의 CRISPR-Cas9 엔지니어링.(A) C. elegans에서 sod-1 유전자 자리의 엑손-인트론 구조를 묘사한 개략도. 빨간색 막대는 엑손 3에서 G93의 위치를 나타냅니다. 프라이머 쌍 세트는 빨간색 화살표(F1-R1)로 표시됩니다. (B) 인간과 예쁜꼬마선충(C. elegans, 웜) SOD-1 단백질의 염기서열 정렬. 표적화된 G93 잔류물은 빨간색으로 강조 표시됩니다. (C) 상단에는 G93 코돈을 둘러싼 게놈 DNA의 한 부분이 참...

재료

<표 테두리="0" cellpadding="0" cellspacing="0" 스타일="너비:839px;" 너비="839"> 이 논문에 사용된 재료 목록 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 뉴클레아제가 없는 물 주식회사 신테고 sgRNA 키트 EZ 키트와 함께 제공 KCl 시그마 P5405 (영문) DNA 클린 & 컨센트레이터 자이모 리서치 D4004 Zymoclean 젤 DNA 회수 키트 자이모 리서치 D4002 Q5 핫 스타트 하이파이 2X 마스터 믹스 뉴잉글랜드 바이오랩스 M0494엘 단백질 분해 효소 K 시그마 P2308 (영문) MgCl2 시그마 M2393 NP-40 시그마 74385 tween-20 피셔 사이언티픽 BP337-100 (영문) RNaseZap 오염 제거 솔루션 피셔 사이언티픽 AM9780