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이 프로토콜은 Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌
한 것입니다.
1. 지질의 나일 레드 (NR) 염색
- 5 mg/mL NR 원액 준비
- 500mL 병에 100mL의 100% 아세톤에 100mg의 NR 분말을 추가합니다.
- 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 호일로 병을 덮으십시오.
- 사용하기 전에 어두운 곳에서 2시간 동안 용액을 저어줍니다.
- 장기간 사용하려면 NR 원액을 빛에 노출되지 않도록 단단히 밀봉된 병에 보관하십시오. 연구 요구 사항에 따라 NR 스톡 솔루션을 확장합니다. 일관된 염색 및 이미징 결과를 얻기 위해 NR 염색 실험 전반에 걸쳐 동일한 원액을 사용하는지 확인합니다.
- NR 작업 솔루션 준비
- 40% 이소프로판올(v/v) 1mL마다 6μL의 NR 원액을 추가합니다.
- 각 샘플에 대해 600μL의 NR 작업 용액을 준비합니다.
참고: 염색 직전에 새로운 NR 작업 용액을 만드십시오. NR 원액 요구 사항에 따라 15mL 또는 50mL 눈금이 매겨진 원뿔형 튜브를 사용합니다.
- NR 지질 염색을 위한 웜 준비
- 후기 로그 OP50 E. coli를 파종한 선충 성장 배지(NGM)에서 20°C에서 초기 L4 단계로 벌레를 성장시킵니다.
- 1x 인산염 완충 식염수 1mL + 0.01% Triton X-100(PBST) 용액으로 플레이트에서 웜을 씻어내고 웜 현탁액을 1.5mL 마이크로분리 튜브에 넣습니다.
- 560 x g에서 1분 동안 기생충을 원심분리하고 상층액을 제거하고 현탁액에서 대장균이 제거될 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 웜 펠릿에 100μL의 40% 이소프로판올을 추가하고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 560 x g에서 1분 동안 기생충을 원심분리하고 지렁이 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
참고: 더 큰 플레이트를 사용하거나 플레이트당 더 많은 웜을 염색하는 경우 더 많은 양의 PBST를 사용하여 플레이트에서 벌레를 씻어냅니다. 샘플 고정 15분 전에 PBST에서 벌레를 세척하지 마십시오. 상층액에 박테리아가 제거되지 않은 경우 추가 세척을 수행하십시오. 너트레이터 또는 로커를 사용하여 40% 이소프로판올에서 배양을 수행합니다. 항상 튜브를 모니터링하여 전체 샘플 교반이 발생하는지 확인하십시오.
- NR을 이용한 지질 염색
- 어두운 곳에서는 각 샘플에 600μL의 NR 작업 용액을 추가합니다. 튜브를 세 번 뒤집고 NR 용액에 웜을 완전히 혼합합니다.
- 샘플을 실온에서 2시간 동안 어두운 곳에서 회전시킵니다.
- 배양 후 560 x g에서 1분 동안 기생충을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
- 600μL의 PBST를 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양하여 과도한 NR 염색을 제거합니다.
- 560 x g에서 1분 동안 샘플을 원심분리하고 약 50μL의 상층액을 제외한 모든 것을 제거합니다.
참고: NR 배양에는 교반이 필요하지 않습니다. 이 단계에서는 웜이 정착하는 것이 일반적입니다.
- 현미경 이미징을 위한 슬라이드 준비
- 웜 펠릿을 남아있는 상층액에 재현탁시킵니다.
- 현미경 슬라이드에 5μL의 웜 현탁액을 놓고 기포가 갇히지 않도록 조심스럽게 커버슬립을 착용합니다.
- 벌레를 이미징하기 전에 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.
- 한 번에 몇 개의 슬라이드만 준비합니다. 이렇게 하면 NR 이미징이 샘플 간에 일정하게 유지됩니다. NR 염색 이미지의 품질은 6시간 후에 떨어집니다. 이산 지질 방울은 관찰하기 어렵고 배경 형광이 증가하여 NR 신호 감지를 방해합니다.
- NR 염색 기생충의 이미징
- 5X 배율로 지렁이를 이미지화하여 시야당 여러 동물을 캡처할 수 있습니다.
- 개별 웜을 더 잘 정량화하기 위해 10X 배율로 전환하십시오.
- FITC/GFP 채널을 사용하여 NR 염색 기생충을 이미지화하고 다양한 노출 시간을 시도하여 정량화를 위한 최적의 조건을 결정할 수 있습니다.
- 압축으로 인한 데이터 손실을 방지하기 위해 파일을 TIF 형식으로 저장하십시오.
참고: 일반적인 노출 시간 범위는 100-1000ms입니다. 최적의 노출 시간을 갖는 경우 모든 샘플에 사용하여 이미징 일관성을 유지할 수 있습니다.