Caenorhabditis elegans의 단일 세포 해리: 살아있는 세포를 분리하는 방법

초록

출처: Germany, E. M., et al. 회충 Caenorhabditis elegans에서 특정 뉴런 개체군의 격리. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 전체 벌레를 온전한 세포의 FACS 또는 면역침전에 적합한 단일 세포 현탁액으로 해리하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Germany et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

1. 세포 분리를 위한 노화된 벌레의 준비 및 수집

참고: 아래에 설명된 내용은 미네소타 대학의 CGC(Caenorhabditis Genetics Center) 균주 저장소에서 얻은 형질전환 unc-17::GFP 균주(OH13083)에서 콜린성 뉴런을 분리한 것입니다. 곰팡이나 박테리아로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.

1. T. Stiernagle이 설명한 표백 방법을 통해 웜을 준비하고 동기화합니다. 노화 실험의 경우 25μM의 플루오로데옥시우리딘(FuDR) 수용액이 포함된 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에 플레이트를 삽입하여 알 생산을 줄이고 알 부화를 저지합니다. 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있으므로 오염이나 알 부화를 방지하기 위해 정기적으로 한천 플레이트를 검사하십시오.
   참고: unc-17::GFP 세포의 경우 일반적으로 3개의 100mm x 15mm NGM 플레이트를 사용하여 충분한 양의 관심 세포를 분리합니다.
2. 웜을 수집하고 세포 분리를 위한 완충액을 준비합니다.
   1. 15mL 원뿔형 튜브에 벌레를 수집합니다. 1.5mL의 M9 버퍼(1mM MgSO₄, 85mM NaCl, 42mM Na₂HPO4·7H₂O, 22mM KH₂PO, pH 7.0)로 플레이트에서 웜을 세척하고 1,600 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 1mL의 M9 버퍼로 지렁이를 세척합니다. 원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 가능한 한 많은 대장균 오염을 제거합니다.
      참고: 이 단계에서 암피실린과 같은 항생제(50μg/mL)를 추가하면 박테리아 오염을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
   2. 두 개의 샘플에 대해 2mL의 도데실황산나트륨-디티오트레이톨(SDS-DTT) 용해 완충액(200mM DTT, 0.25%(w/v) SDS, 20mM HEPES(pH 8.0) 및 3%(w/v) 수크로스)를 준비합니다.
   3. 15mL의 분리 완충액(118mM NaCl, 48mM KCl, 2mM CaCl₂, 2mM MgCl₂, 25mM HEPES[pH 7.3])을 준비하고 ice.
      에 보관합니다. 참고: SDS-DTT 용해 완충액과 분리 완충액은 모두 각 실험 전에 새로 만들어야 합니다.
3. 큐티클 파괴 및 단일 세포 분리
   1. 1.2.1단계에서 1,600 x g에서 5분 동안 수집한 원심분리기 동물. 1mL의 M9 배지에서 모든 상층액 및 현탁액 웜을 제거하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 1,600 x g에서 5분 동안 원심분리한 펠릿 웜.
   3. 200μL의 SDS-DTT 용해 완충액을 웜에 추가하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 광학 현미경으로 볼 때 몸을 따라 "윙클"하는 것처럼 보여야 합니다.
      참고: SDS-DTT 용해 완충액에 장기간 노출되면 기생충이 사멸할 수 있으며, 이는 기생충을 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 죽은 벌레는 길어지고 말리지 않습니다.
   4. 800μL의 얼음처럼 차가운 분리 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합합니다.
   5. 4°C에서 13,000 x g에서 1분 동안 펠렛 웜을 투여하고 상층액을 제거한 후 1mL의 분리 버퍼로 세척합니다.
   6. 1.3.5단계를 총 5회 반복하면서 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
   7. 분리 완충액에 용해된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)(15mg/mL)(재료 표)의 프로테아제 혼합물 100μL를 펠릿에 추가하고 RT.
      에서 10−15분 동안 배양합니다. 참고: SDS-DTT 용해 완충액과 마찬가지로, 확장된 단백질 분해 효소는 원형질막을 따라 단백질의 과도한 절단을 초래할 수 있으며, 이로 인해 마그네틱 비드를 통해 표면에 노출된 GFP가 분리되는 것을 방지할 수 있습니다.
   8. 프로테아제 혼합물로 배양하는 동안 200 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브의 바닥에 샘플을 위아래로 피펫팅하여 ~60−70회 기계적 파괴를 가합니다. 피펫 팁을 마이크로 원심분리 튜브의 벽에 대고 일정한 압력으로 세포를 적절하게 분리하십시오.
   9. 분해 단계를 결정하려면 소량의 분해 혼합물(~1-5 μL)을 제거하고 유리 슬라이드에 떨어뜨린 다음 조직 배양 현미경을 사용하여 검사합니다. 5-7분의 배양 후, 벌레 조각은 표피가 눈에 띄게 감소하고 세포의 슬러리가 쉽게 보일 것입니다.
   10. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신에서 최종 농도)이 보충된 900 μL의 시판되는 저온 Leibovitz의 L-15 배지로 반응을 중단합니다.
   11. 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 단편과 세포를 펠렛으로 분리합니다. 펠릿화된 세포를 1mL의 차가운 L-15 보충 배지로 두 번 더 세척하여 과도한 파편과 큐티클이 제거되었는지 확인합니다.
   12. 펠릿화된 세포를 L-15 보충 배지 1mL에 재현탁시키고 얼음 위에 30분 동안 방치합니다. 약 700−800 μL의 최상층을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 이 층은 세포 파편이 없는 세포를 포함하며 관심 세포의 후속 분리에 사용됩니다.
   13. 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 10-25 μL의 분리된 세포의 세포 밀도를 측정합니다.

재료