에탄올 고정 및 DAPI 염색: 예쁜꼬마선충에서 DNA를 시각화하는 방법

초록

출처: Clarke, E. K., et al. Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans. J. Vis. 특급 (2018).

여기에서는 고정되고 손상되지 않은 선충에서 게놈 DNA를 시각화하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 비디오에는 수정되지 않은 예쁜꼬마선충 난모세포에서 염색질을 계수하는 프로토콜의 예가 포함되어 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

사배체 균주는 수정되지 않은 난모세포의 염색체 수를 세어 검증할 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 균주에 염색체에 대한 형광 마커가 있는 경우 수정되지 않은 이배체 난모세포(감수분열 이전)의 염색체 쌍 수를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 염색체 마커가 없는 경우, 사배체 선충은 선충을 고정하고 DNA 염료로 염색하여 스크리닝할 수 있습니다. 에탄올 고정 및 전체 동물 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride(DAPI) 염색에 대한 프로토콜은 아래를 참조하십시오.

전체 동물 DAPI 염색

참고: 12개의 연결된 염색체 쌍을 가진 사배체 균주는 DAPI가 이러한 동물을 염색하고 수정되지 않은 난모세포의 DAPI 본체 수를 계산하여 검증할 수 있습니다.

1. 5 - 10 μL의 M9 버퍼를 현미경 슬라이드에 놓고 6 - 10개의 선충을 드롭으로 옮깁니다.
2. 해부 현미경으로 보푸라기가 없는 세척 조직으로 선충을 제거하지 않고 방울에서 대부분의 M9를 뽑습니다. 그런 다음 즉시 90% 에탄올 10μL 방울을 웜에 떨어뜨립니다. 벌레가 완전히 건조되도록 하되 몇 초 이상 말리지 마십시오.
3. 에탄올이 증발하자마자(이는 해부 현미경에서 볼 수 있음) 10μL의 90% 에탄올을 웜에 추가로 첨가합니다.
4. 3.1.3단계를 세 번 더 반복합니다.
5. 마지막 에탄올 한 방울이 증발하면 선택한 장착 매체에 권장 최종 농도로 6μL의 DAPI 또는 Hoechst 염료를 추가합니다(예: M9에서 2ng/μL DAPI 스톡 농도의 1:1,000 희석). 슬라이드의 장기 보관을 위해 M9 대신 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 90 % 글리세롤에 용해 된 0.5 % p- 페닐 렌 디아민을 퇴색 방지 용액으로 사용할 수 있습니다.
6. 슬라이드의 벌레를 커버슬립으로 덮고 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 커버슬립을 추가한 후 최소 10분 후에 형광 현미경(3.1.7단계)에서 점수를 매깁니다. 퇴색 방지 기능이 없는 슬라이드는 채점 전에 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있지만 며칠 후에 형광 품질이 떨어지기 시작합니다.
7. 100X 배율의 형광 현미경을 사용하여 정자에 바로 인접하고 아직 정자 또는 자궁에 들어가지 않은 가장 성숙한 수정되지 않은 난모세포에서 단일 DAPI체(아마도 단일 염색체 쌍)의 수를 평가합니다.
   1. 난모세포 핵 내의 개별 DAPI 본체를 채점하려면 현미경의 미세 초점을 사용하여 계수하는 동안 난모세포 핵의 상단에서 하단으로 천천히 이동합니다. 그런 다음 초점을 반대 방향(즉, 핵의 아래에서 위쪽으로)으로 이동하면서 동일한 핵을 다시 계산하여 계산된 DAPI 본체 수를 확인합니다.
8. 안정적인 Lon 균주당 최소 10개의 자웅동체에서 두 생식선 각각에서 가장 성숙한 수정되지 않은 난모세포를 점수화합니다. 야생형 난모세포는 평균 6개의 DAPI 몸체, 5개의 상염색체 쌍 및 성염색체 쌍을 가지고 있습니다. 안정된 Lon 균주의 난모세포에 12개의 DAPI 몸체가 존재한다는 것은 이 균주의 동물이 부분적(4세트의 상염색체, 3개의 X-염색체) 또는 완전한(4세트의 상염색체, 4개의 X-염색체) 사배체임을 나타냅니다.
9. 균주당 여러(최소 10개)의 난모세포에서 관찰된 DAPI 본체의 평균 수를 계산합니다. 일부 염색체 쌍은 서로 닿거나 바로 위에 있기 때문에 난모세포의 DAPI 본체 수는 실제 염색체 쌍의 수보다 작은 경우가 많습니다.
10. (선택 사항) HTP-3와 같은 염색체 축 단백질에 대한 면역형광 염색에 의해 사배체가 전체(4A, 4X) 또는 부분(4A, 3X) 사배체인지 여부를 테스트하기 위해 DAPI 본체의 평균 수가 12인 안정적인 Lon 균주를 추가로 검증합니다. 이 염색은 부분 사배체에 존재하는 단일 연결되지 않은 염색체에서 십자형 패턴을 보여줌으로써 염색체 쌍을 구별합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
해부 현미경	Motic 현미경 검사	SMZ171
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
얼룩
Hoechst 33258, 펜타하이드레이트	비오티움	40045
DAPI	비오티움	40011
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
에탄올 고정
에탄올, 순수, 190프루프(95%), USP	콥텍, VWR	89125-166
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
M9 버퍼
염화나트륨, 생명공학 등급	폭스바겐	97061-278
인산칼륨, 일염기성 무수 등급	폭스바겐	97062-346
인산 나트륨, 일 염기성 이수화 물	피셔 사이언티픽	AC271750025