SWIP(Swimming-Induced Paralysis) 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 도파민 매개 운동을 정량화하는 방법

초록

출처: Kudumala, S., et al. Caenorhabditis elegans에서 도파민 신호를 평가하기 위한 수영 유도 마비. J. vis. 특급.(2019).

여기에서는 수영과 같은 격렬한 움직임 중에 발생하는 예쁜꼬마선충의 행동 표현형인 SWIP를 측정하기 위한 분석을 소개합니다. 예제 프로토콜은 수동 및 자동 분석 접근 방식에 대해 설명합니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

SWIP

참고: AMPH로 처리된 야생형 웜에서 SWIP을 평가하는 수동 방법을 설명합니다. 또한 이전에 Hardaway et al.이 설명한 자동화된 웜 추적기 및 추적 소프트웨어를 사용하여 웜 추적 및 웜 역학의 추가 분석과 웜 추적에 대해 간략하게 설명합니다.

1. SWIP를 테스트하는 수동 방법
   1. 0.5mM AMPH의 유무에 관계없이 200mOsm/L 자당 용액의 40μL를 유리 스폿 플레이트에 분취합니다. 입체경 아래에서 속눈썹 또는 백금 픽으로 8-10개의 후반 L4 스테이지 웜을 선택하고 웜이 픽에서 벗어나 용액으로 헤엄쳐 들어갈 때까지 솔루션이 들어 있는 플레이트에 픽을 담급니다. 우물에 집어넣은 벌레의 수를 기록하고, 타이머를 시작하고, 매 분 표시에서 SWIP를 보이는 벌레의 수를 관찰하고 기록합니다.
   2. 원시 데이터를 스프레드시트에 복사하고 매분마다 마비된 웜 수를 분석 전체에서 테스트된 총 웜 수로 나누어 마비된 웜의 백분율을 계산하고 100을 곱합니다. 퍼센트 값을 그래프 및 통계 소프트웨어에 복사하고 XY 그래프 형식을 사용하여 Y축에 퍼센트 값, X축에 시간으로 데이터를 플롯합니다.
   3. 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행한 후 사후 분석(예: Bonferroni 사후 테스트)을 수행하여 대조군, AMPH 그룹 및 치료 시간 간의 통계적 유의성을 테스트합니다.
2. SWIP의 자동화된 분석
   1. 한 번에 하나의 웜에 대해 자동 분석을 수행합니다. 카메라를 설정하기 위한 프로토콜, 웜 추적기 소프트웨어 및 추적 소프트웨어 분석을 실행하기 위한 스크립트는 Hardaway et al.에 자세히 설명되어 있습니다.
   2. 간단히 말해서, 섹션 1.1.2의 수동 방법에 설명된 대로 속눈썹 픽을 사용하여 단일 후기 L4 단계 자웅동체를 유리 스폿 플레이트에 놓습니다. 한 번에 한 웜의 수영 비디오를 기록하고 웜 추적기 소프트웨어를 사용하여 몸이 구부러지는 빈도를 계산합니다.
   3. 추적 소프트웨어와 함께 제공된 스크립트에 따라 웜 스래싱 빈도를 얻고 웜 스래싱 데이터에서 히트 맵을 생성합니다.

재료

<표 테두리="0" cellpadding="0" cellspacing="0" 스타일="너비:711px;" 너비="711"> 이 논문에 사용된 재료 목록 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 암페타민 시그마 51-63-8 함몰 유리 스폿 플레이트 코 닝 코닝(Corning, Inc.) 722085 속눈썹 그래프 및 통계 소프트웨어 프리즘 그래프패드 5 삼투 미터 고급 악기, Inc 모델 3320 스프레드 시트 MS 오피스 마이크로소프트 엑셀 스테레오 현미경 자이스 모델 tlb3. 1 스템i2000 설탕 시그마-알드리치 RB=S5016 초 접착제 록타이트 1647358 .14 온스. SwimR 소프트웨어 10.18129/B9.바이오C.스윔R 추적기 2 웜 트래커 2.0 www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ 비디오 녹화 소프트웨어 버추얼더빙 http://www.virtualdub.org/