예쁜꼬마선충 공급을 위한 RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

초록

출처: Kolundzic, E., et al. 예쁜꼬마선충의 뉴런으로 생식 세포를 재프로그래밍하기 위한 RNAi 및 열 충격 유도 전사 인자 발현의 응용. J. Vis. 특급.(2018).

이 비디오는 예쁜꼬마선충에서 RNAi 처리의 원리를 설명하고 형질전환 웜 균주에서 lin-35를 knockdown하는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Kolundzic, et al, 예쁜꼬마선충의 뉴런에 생식 세포를 재프로그래밍하기 위한 RNAi 및 열 충격 유도 전사 인자 발현의 적용, J. Vis. Exp. (2018).

1. 솔루션 준비
   1. NGM-한천 플레이트(1L)
      1. NaCl 3g, 펩톤 배지(예: Bacto-Peptone) 2.5g, 한천 20g을 추가합니다. 오토클레이빙 후 콜레스테롤 1mL(95% EtOH 스톡 중 5mg/mL), 1M MgSO₄ 1mL, 1M CaCl2 1mL, 1M K2PO₄ 25mL 및 암포테리신 B 1mL(2.5mg/mL 스톡)를 추가합니다.
   2. NGM-한천 RNAi 플레이트(1L)
      1. NaCl 3g, 펩톤 배지 2.5g, 한천 20g을 추가합니다. 오토클레이브 후 콜레스테롤 1mL(95% EtOH 스톡 중 5mg/mL), 1M MgSO₄ 1mL, 1M CaCl2 1mL, 1M K_2PO4 25mL, 암포테리신 B 1mL(2.5mg/mL 스톡), 1M IPTG 1mL 및 카르베니실린 1mL(50mg/mL)를 추가합니다.
   3. LB-한천 (1L)
      1. 펩톤 배지 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 20g, 1M Tris pH 8.0 10mL를 추가합니다. H₂O를 1L에 첨가합니다. 오토클레이빙 후 50mg/mL 카르베니실린 1mL와 5mg/mL 테트라사이클린 2.5mL를 추가합니다.
   4. LB 미디엄(1L)
      1. 펩톤 배지 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 10M Tris pH 1.0 mL를 추가합니다. H₂O를 1L에 첨가합니다. 오토클레이빙 후 50mg/mL 카르베니실린 1mL를 첨가합니다.
   5. M9 버퍼(1L)
      1. Na₂HPO₄ 6.0g, KH₂PO₄ 3g, NaCl 5g 및 젤라틴 50mg을 추가합니다. 사용하기 전에 1M MgSO₄ 1mL를 첨가하십시오.
   6. 표백 용액 (10mL)
      1. NaClO 1mL와 5N NaOH 2mL를 추가합니다. H2O를 10mL에 첨가합니다.
2. RNAi 플레이트의 준비
   참고: C. elegans는 일반적으로 실험실에서 7.5mL의 선충 성장 배지 한천(NGM-Agar)을 포함하는 6cm 페트리 플레이트에서 배양됩니다. 이 프로토콜은 15°C에서 유지되는 웜에 최적화되어 있습니다. NGM으로 플레이트를 준비하려면 표준 멸균 기술을 사용하여 곰팡이 및 박테리아 오염을 방지하십시오. 다음은 RNAi용 시약이 보충된 NGM 플레이트를 제조하는 프로토콜입니다.
   1. 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 50μg/mL 카르베니실린을 포함하는 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트를 준비합니다. 어두운 곳에서 실온에서 24 – 48시간 동안 건조시키십시오¹².
      1. 어두운 곳에서 RNAi 플레이트를 4°C로 유지하십시오. 14일이 지나지 않은 경우 사용하지 마십시오.
   2. 3상 줄무늬 패턴을 사용하여 50μg/mL 카르베니실린 및 12.5μg/mL 테트라사이클린을 포함하는 LB-한천 플레이트의 사용 가능한 RNAi 플레이트에서 냉동 글리세롤 스톡의 lin-53 유전자 DNA 염기서열과 함께 L4440 플라스미드를 포함하는 RNAi 박테리아(Escherichia coli HT115) 클론을 선택합니다. 박테리아를 37°C에서 밤새 성장시킵니다. 이 클론은 박테리아에서 lin-53 dsRNA의 IPTG 의존적 생산을 가능하게 합니다.
      1. 또한, 유전자 염기서열 없이 L4440 플라스미드를 포함하는 RNAi 박테리아를 빈 벡터 대조군으로 성장시킵니다.
   3. 다음 날, 200μL 피펫 팁을 사용하여 lin-53 또는 빈 벡터 LB-한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 50μg/mL 카베니실린이 보충된 2mL의 액체 LB 배지가 들어 있는 별도의 배양 튜브에 각각을 접종합니다. 600 nm에서 0.6 – 0.8의 광학 밀도(OD)에 도달할 때까지 37°C에서 밤새 배양물을 성장시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 OD를 측정합니다.
      주의: 액체 LB 매체에는 글리세롤 스톡에서 박테리아를 제거하는 데 사용되는 LB-한천 플레이트와 달리 테트라사이클린이 포함되어서는 안 되는데, 이는 공급 중에 테트라사이클린을 포함하면 RNAi 효율이 감소하기 때문입니다.
   4. 멀티피펫을 사용하여 각 박테리아 배양액(lin-53 또는 빈 벡터) 500μL를 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트에 추가합니다. 뚜껑을 닫은 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 밤새 배양하여 건조시킵니다. 이 기간 동안 NGM 플레이트의 IPTG는 박테리아에서 dsRNA의 생산을 유도합니다.
      1. 실험당 박테리아 배양당 최소 3개의 플레이트를 사용합니다. 이렇게 하면 각 실험에 대해 3개의 기술적 재현이 제공됩니다.
   • 박테리아와 함께 건조된 NGM-한천 RNAi 플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
3. 예쁜꼬마선충 균주 BAT28의 준비
4. 15°C에서 표준 NGM-Agar plate를 사용하여 OP50 박테리아에서 전이유전자 otIs305[hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1[gcy-5prom::gfp]을 포함하는 웜 균주 BAT28을 유지합니다.
   참고: 선충 배양에 대한 자세한 프로토콜은 다음을 참조하십시오. rol-6(su1006)은 우성 대립유전자이며 일반적으로 사용되는 표현형 주입 마커¹⁶으로 전형적인 롤링 움직임을 유발합니다. otIs305 전이유전자에서 hsp-16.2prom::che-1을 추적하는 데 사용됩니다.
   1. HSP-16.2PROM::che-1 전이유전자의 부주의한 활성화를 방지하기 위해 BAT28 균주를 항상 15°C로 유지하십시오. 15°C 이상의 온도에 대한 노출을 줄이면서 변형을 최대한 많이 취급합니다.
5. 지렁이의 나이를 동기화하려면 표백 기술을 사용하십시오.
   1. 900μL M9 완충액을 사용하여 BAT28의 성체와 난자가 들어 있는 6cm NGM-Agar 플레이트를 씻어냅니다. 900 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿 웜을 만듭니다. 상층액을 제거합니다.
   2. 0.5 – 1mL의 표백 용액을 넣고 성충이 터지기 시작할 때까지 약 1분 동안 튜브를 흔듭니다. 표준 실체현미경을 사용하여 모니터링합니다.
   3. 900 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿 웜을 제거합니다.
   4. 800μL의 M9 완충액을 첨가하고 900 x g에서 원심분리하여 웜 펠릿을 3회 세척합니다.
   5. 세척된 계란을 OP50 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 플레이트에 놓습니다. OP50 박테리아가 L4 단계(약 4일)에 도달할 때까지 15°C에서 표백된 개체군을 성장시킵니다. L4 유충은 표준 실체현미경을 사용하여 벌레의 복부 쪽을 따라 대략 절반에 있는 흰색 패치로 식별할 수 있습니다.
      참고: lin-53이 고갈될 때 생식 세포에서 뉴런으로의 변환 표현형을 달성하려면 부모 세대(P0)에서 고갈되어야 합니다. 변환 표현형에 대한 점수 매기기는 다음 세대(효도 세대 F1)에서 수행됩니다. P0에 이미 있는 고갈된 lin-53을 달성하기 위해 L4 동물은 RNAi를 투여합니다.
6. 백금 와이어를 사용하여 복제당 50개의 L4 스테이지 웜을 박테리아가 없는 NGM 플레이트로 수동으로 옮기고 웜이 전이된 OP50 박테리아로부터 멀어지도록 합니다. 약 5분 동안 접시 위에서 벌레를 움직이게 합니다. 이전에 lin-53 RNAi 박테리아(또는 빈 벡터 대조군)가 파종된 NGM-Agar RNAi 플레이트의 박테리아를 사용하여 해당 RNAi 플레이트로 이동합니다.
   1. OP50 박테리아가 실제 RNAi 플레이트로 이동하지 않도록 합니다. 15°C 이상의 온도에 대한 변형률의 노출 시간을 최소화하기 위해 빠르게 작업하십시오.
7. 웜의 F1 자손이 L3 – L4 단계에 도달할 때까지 약 7일 동안 15°C에서 NGM-Agar RNAi 플레이트에서 웜을 배양합니다. 그들은 F1 자손보다 크고 두껍기 때문에 P0 동물과 명확하게 구분 될 수 있습니다.
   1. 표준 실체현미경으로 F1 자손 웜이 그림 1과 같이 돌출된 외음부(pvul) 표현형을 보이는지 육안으로 확인합니다. lin-53에 대한 RNAi는 pleiotropic 효과를 가지며 lin-53에 대한 RNAi가 성공적이었는지 여부를 평가하는 데 사용할 수 있는 pvul 표현형을 유발합니다.
      참고: lin-53에 대한 RNAi는 F1 배아의 치사율을 유발할 수도 있습니다. 이 효과는 동물이 L3 – L4 단계에 도달하기 전에 플레이트가 15°C보다 높은 온도에 노출되면 증가합니다. 죽은 배아는 정지된 발달과 부화의 부족으로 인식될 수 있습니다.
   2. IPTG는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 플레이트를 배양하십시오.

결과

그림 1: lin-53에 대한 RNAi에 의해 유발된 Pvul 표현형. (위) 대조군 또는 lin-53 RNAi 처리녀에서 유래한 L4/젊은 성인 단계 F1 자손 벌레의 DIC 그림. 스케일 바 = 20 μm. (아래) lin-53 RNAi로 처리된 동물은 돌출된 외음부(pvul) 표현형(검은색 화살촉)을 나타냅니다. pvul 표현형은 lin-53에 대한 RNAi가 성공적이었음을 확인합니다. 스케일 바 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학 물질
한천, 고베 I	로스	5210.1
박토펩톤	A. 하텐슈타인 GmbH	211 677	펩톤 배지
효모 추출물	애플리켐	A1552,0100
암포테리신 B	USB생물학	A2220
CaCl2	머크 바이오사이언스	208290
콜레스테롤	로스	8866.2
젤라틴	로스	4275.3
IPTG	시그마	15502-10지
K2PO4	로스	T875.2
KH2PO4	로스	3904.2
MgSO4	폭스바겐	25,163,364
Na2HPO4	로스	P030.1
NaCl	로스	9265.1
NaClO	로스	9062.3
NaOH (5 N)	로스	KK71.1
트리스	로스	AE15.2
카르베니실린	로스	634412
테트라사이클린	로스	2371.2
인큐베이터
인큐베이터	산요 MIR-5	5534210	15 °C 또는 25 °C에서 웜 균주 유지용
현미경
실체현미경	SMZ745	니콘
세균 균주
대장균 HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 용해원: lavUV5promoter -T7 중합효소) (IPTG 유도성 T7 중합효소) (RNAseIII 마이너스).
대장균 OP50			Uracil auxotroph E. coli 균주
웜 균주
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			N2를 가진 4배 배 더 많은 후에 교차에 의하여 OH9846에서 파생하는
RNAi 클론
출처바이오사이언스	아이디 I-4D14	Ahringer 라이브러리 16B07 ChromI, K07A1.12
빈 베터: L4440	애드진	#의 1654

호 명 < >lin-53