액체 배양에서 RNAi 공급: 예쁜꼬마선충에서 유전자 발현을 knockdown하는 고처리량 방법

초록

출처: Groh, N. et al. Caenorhabditis elegans에서 연령에 따른 고유 단백질 응집의 변화를 연구하는 방법. J. Vis. 특급.(2017).

RNAi는 예쁜꼬마선충 연구자들이 사용할 수 있는 강력한 유전 도구입니다. 이 동영상은 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 기생충을 처리하는 방법을 소개합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Groh et al, Caenorhabditis elegans에서 연령에 따른 고유 단백질 응집의 변화를 연구하는 방법, J. Vis. Exp. (2017).

1. 관심 유전자를 표적으로 하는 RNAi에 노출된 젊고 늙은 동물을 수집하기 위한 생식선이 없는 동물의 액체 배양

참고: RNAi에 대한 일부 유전자의 반응은 앞서 설명한 바와 같이 온도에 따라 달라질 수 있습니다. RNAi의 대안으로, 돌연변이 유전자는 gon-2(-) 배경에 통합될 수 있습니다.

1. 액체 배양을 위한 박테리아 준비
   1. 4L LB 배지에 12mL의 각 박테리아 배양액을 접종하여 OP50 및 RNAi 박테리아(빈 벡터를 대조군으로 하여 원하는 dsRNA를 생산하는 박테리아 및 박테리아)를 준비하고 (RNAi 박테리아 배양액에 50μg/mL 카르베니실린 및 1mM IPTG의 최종 농도 추가) 37°C에서 180rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 다음날 6,700 x g에서 4°C에서 10분 동안 배양물을 수확합니다. 상등액을 제거하고 각 펠릿을 60mL의 얼음처럼 차가운 S 기초 매체(100mM NaCl, 50mM 인산칼륨 pH 6, 얼음에 보관)에 재현탁합니다. 3개의 재현탁 펠릿(OP50, 대조군 RNAi 박테리아 및 관심 유전자에 대한 RNAi 박테리아)을 1.2.
      단계까지 4°C에서 유지합니다. 참고: 벌레는 L1 단계에서 RNAi에서 성장하거나 마지막 유충 단계 L4의 발달 결함을 방지하기 위해 성장할 수 있습니다(1.2단계 참조).
2. 마지막 유충 단계 L4에서 시작하는 RNAi 치료를 위한 액체 배양
   1. Fernbach 배양 플라스크(용량 2,800mL)에 200mL S 기초 배지를 추가합니다. 300mL의 최종 배양 부피(1.2.2.4 참조)를 위해 10mM 구연산칼륨, pH 6, 3mL 미량 금속 용액(5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 2.5mM FeSO₄, 1mM MnCl₂, 1mM ZnSO₄, 0.1mM CuSO₄), 3mM MgSO₄, 3mM CaCl₂, 100ng/mL 카르벤다짐 및 5μg/mL 콜레스테롤). 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다. 버퍼 레시피에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
   2. 25°C에서 L1을 꺼내 15mL 튜브로 옮깁니다. 1,900 x g에서 3분 동안 원심분리기를 진행하고, 상층액을 제거하고, 2 μL당 L1을 계수합니다.이전 단계에서 준비한 Fernbach 배양 플라스크에 500,000 L1을 추가합니다.
   3. OP50(1.1단계)을 웜 수에 비례하여 추가합니다. 예를 들어, 500,000개의 웜의 경우 60mL OP50을 추가합니다.
   4. S 염기를 사용한 완전한 웜 배양을 통해 총 부피를 300mL로 만듭니다. 150rpm의 진탕 인큐베이터에서 25°C의 L4 단계까지 웜 배양을 배양합니다.
   5. 다음 날, 지렁이는 야생형 L4 크기여야 합니다. OP50에서 RNAi 박테리아로 변경하려면 6개의 50mL 튜브에 동물을 모아 침전시키고 상층액을 제거합니다. 잔류 OP50 박테리아를 제거하기 위해 L4를 M9로 세척합니다: 1900 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 모든 L4를 하나의 50mL 튜브로 옮깁니다. 5μL당 L4를 계산합니다(최소 9회). 어린 지렁이 수집을 위해 두 번 50,000개의 L4가 필요하고 오래된 지렁이 수집을 위해 두 번 100,000개의 L4가 필요합니다.
   6. 1.2.2.1에 설명된 대로 Fernbach 배양 플라스크 4개를 준비합니다. 또한 각 플라스크에 50μg/mL 카르베니실린과 1mM IPTG의 최종 농도를 추가합니다.
   7. 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아 및 RNAi 박테리아를 (단계 1.1에서) 벌레 수에 비례하여 추가합니다: 어린 벌레의 경우 플라스크당 7mL, 오래된 벌레의 경우 플라스크당 14mL를 추가합니다.
   8. 어린 지렁이 수집을 위해 플라스크당 50,000개의 지렁이를 추가하고 숙성된 지렁이 수집을 위해 플라스크당 100,000개의 지렁이를 추가하고 S basal로 배양을 완료하여 최대 300mL를 채웁니다. 벌레 배양물(총 4개)을 25°C 및 150rpm에서 배양합니다.

2. 예쁜꼬마선충 액체 배양의 유지 관리

1. 각 액체 배양액에서 주기적으로 부분 표본을 채취하여 유리 슬라이드(또는 한천 플레이트)에 올려 오염이 없는지 확인합니다. 해부 현미경을 사용하여 특히 성장 단계에서 배양액의 박테리아 식품 수준을 확인합니다. 1.1단계에서 설명한 대로 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아 및 RNAi 박테리아의 2L 배양을 미리 준비합니다. 필요한 경우 C. elegans 액체 배양액에 추가하고 나머지는 4°C로 유지합니다.
2. 동물이 불임 상태인지 주기적으로 확인하십시오. 대부분의 동물은 생식선이 없습니다. 곤-2 돌연변이의 침투 정도에 따라, 일부는 생식선 구조를 중단시켰을 수도 있지만, 알을 가진 동물은 관찰되어서는 안 된다.

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재고 솔루션	분량	최종 집중	코멘트/설명
S 기저(500mL의 경우: 5.9g NaCl, 50 mL 1 M 인산칼륨 pH 6)	200 밀리리터		1 M 인산칼륨 pH 6 : 1 L : 129 g KH2PO4 monobasic, 52g K2HPO4 이염기성 무수
1 M 구연산칼륨 pH 6 (400mL의 경우: 구연산 일수화물 13.1g, 134.4 g tri-potassium citrate 일수화물)	3 밀리리터	10 밀리미터미터
미량 금속 용액 (1L의 경우: 1.86g 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.69g FeSO4 · 7 H2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025g CuSO4 · 5H2O)	3 밀리리터		원액은 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오
1M MgSO4 (500mL 용: 123.3g)	900 마이크로L	3 밀리엠
1 M CaCl2 (500 mL의 경우: 73.5 g)	900 마이크로L	3 밀리엠
200 μg/mL 카벤다짐 (50mL의 경우 : 메탄올 10mg)	150 μL	100 ng / mL
5mg/mL 콜레스테롤 (100mL의 경우: 에탄올 0.5g)	300 마이크로L	5 μg/mL

표 1.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fernbach 배양 플라스크	코 닝	4425-2XL	Pyrex, 용량 2,800 ml, 3 개의 배플 들여 쓰기 포함	예
멤브레인 스크류 캡	쇼트	1E+06	GL45	예
너트 믹서	폭스바겐	444-0148		예
분리 깔때기	날진	4300-1000	용량 1,000 ml	아니요
주사기 1ml	BD 플라스티팍	3E+05		아니요
회색 바늘, 27G x 1/2 ", 0.4 mm x 13 mm	BD 마이크로랜스 3	3E+05		아니요
멤브레인 필터 0.025 μM	밀리포어	VSWP04700		아니요
pH 스트립	마케리-나겔	92110	pH-픽스 0-14	아니요
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	5E+09	완전한 미니 EDTA 프리 정제	아니요
옥톡시놀-9	애플리켐	A1388	트리톤 X-100	아니요
4-모르폴린에탄설폰산(MES)	시그마-알드리치	M1317		아니요
노닐페닐폴리에틸렌글리콜	애플리켐	대답1694	노니뎃 P40 (NP40)	아니요
DNaseI	로슈	5E+09	재조합, RNase free	아니요
RNaseA	프로메가	A7973	용액	아니요
총 단백질 블롯 염색	써모피셔	S11791	Sypro 루비 단백질 얼룩 얼룩	아니요
총 단백질 겔 염색	써모피셔	S12001	Sypro 루비 단백질 젤 염색	아니요
TCEP (트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 하이드로 클로라이드)	세르바	36970		아니요
요오도아세트아미드	세르바	26710		아니요
암모늄바이카보네이트	시그마-알드리치	9830		아니요
염기서열분석 등급 변형 트립신	프로메가	V5111		아니요
상대 및 절대 정량 분석을 위한 Isobaric tag	사이엑스	4E+06	iTRAQ 시약 멀티플렉스 키트	아니요
원심분리기 Avanti J-26XP	베크만 쿨터	4E+05		예
초원심분리기 Optima Max-XP	베크만 쿨터	4E+05		아니요
원심분리기 5424R	에펜도르프	5E+09		예
원심분리기 5702	에펜도르프	6E+09		예
원심분리기 메가푸지 40R	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	8E+07		아니요
컨센트레이터 플러스	에펜도르프	5E+09	원심 증발기	아니요
형광 실체 현미경 M165 FC	라이카		Planapo 2.0x 대물렌즈 포함	아니요
해부 현미경	라이카		라이카 S6E	예
고배율 현미경 Zeiss Axio Observer Z1	자이스		PlanAPOCHROMAT 20x 대물렌즈 및 Zeiss Axio Cam MRm 사용	아니요
소프트웨어				아니요
이미지 분석 소프트웨어	이미지J			아니요
질량 분석 데이터 분석	단백질 프로스펙터		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	아니요
대장균 균주
오피50	CGC (영어)
RNAi 박테리아
엘4440	Julie Ahringer RNAi 라이브러리
C. 예쁜꼬마선충 돌연변이
CF2253	CGC, 균주 이름: EJ1158		유전자형: gon-2(q388)
C. elegans 형질전환
DCD214	DZNE 튀빙겐의 Della David의 연구실		유전자형: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	DZNE 튀빙겐의 Della David의 연구실		유전자형: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

년 년 호 )