액체 배양에서 RNAi 공급: 예쁜꼬마선충에서 유전자 발현을 knockdown하는 고처리량 방법

초록

출처: Groh, N. et al. Caenorhabditis elegans에서 연령에 따른 고유 단백질 응집의 변화를 연구하는 방법. J. Vis. 특급.(2017).

RNAi는 예쁜꼬마선충 연구자들이 사용할 수 있는 강력한 유전 도구입니다. 이 동영상은 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 기생충을 처리하는 방법을 소개합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Groh et al, Caenorhabditis elegans에서 연령에 따른 고유 단백질 응집의 변화를 연구하는 방법, J. Vis. Exp. (2017).

1. 관심 유전자를 표적으로 하는 RNAi에 노출된 젊고 늙은 동물을 수집하기 위한 생식선이 없는 동물의 액체 배양

참고: RNAi에 대한 일부 유전자의 반응은 앞서 설명한 바와 같이 온도에 따라 달라질 수 있습니다. RNAi의 대안으로, 돌연변이 유전자는 gon-2(-) 배경에 통합될 수 있습니다.

1. 액체 배양을 위한 박테리아 준비
   1. 4L LB 배지에 12mL의 각 박테리아 배양액을 접종하여 OP50 및 RNAi 박테리아(빈 벡터를 대조군으로 하여 원하는 dsRNA를 생산하는 박테리아 및 박테리아)를 준비하고 (RNAi 박테....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fernbach 배양 플라스크	코 닝	4425-2XL	Pyrex, 용량 2,800 ml, 3 개의 배플 들여 쓰기 포함	예
멤브레인 스크류 캡	쇼트	1E+06	GL45	예
너트 믹서	폭스바겐	444-0148		예
분리 깔때기	날진	4300-1000	용량 1,000 ml	아니요
주사기 1ml	BD 플라스티팍	3E+05		아니요
회색 바늘, 27G x 1/2 ", 0.4 mm x 13 mm	BD 마이크로랜스 3	3E+05		아니요
멤브레인 필터 0.025 μM	밀리포어	VSWP04700		아니요
pH 스트립	마케리-나겔	92110	pH-픽스 0-14	아니요
프로테아제 억제제 칵테일	로슈	5E+09	완전한 미니 EDTA 프리 정제	아니요
옥톡시놀-9	애플리켐	A1388	트리톤 X-100	아니요
4-모르폴린에탄설폰산(MES)	시그마-알드리치	M1317		아니요
노닐페닐폴리에틸렌글리콜	애플리켐	대답1694	노니뎃 P40 (NP40)	아니요
DNaseI	로슈	5E+09	재조합, RNase free	아니요
RNaseA	프로메가	A7973	용액	아니요
총 단백질 블롯 염색	써모피셔	S11791	Sypro 루비 단백질 얼룩 얼룩	아니요
총 단백질 겔 염색	써모피셔	S12001	Sypro 루비 단백질 젤 염색	아니요
TCEP (트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 하이드로 클로라이드)	세르바	36970		아니요
요오도아세트아미드	세르바	26710		아니요
암모늄바이카보네이트	시그마-알드리치	9830		아니요
염기서열분석 등급 변형 트립신	프로메가	V5111		아니요
상대 및 절대 정량 분석을 위한 Isobaric tag	사이엑스	4E+06	iTRAQ 시약 멀티플렉스 키트	아니요
원심분리기 Avanti J-26XP	베크만 쿨터	4E+05		예
초원심분리기 Optima Max-XP	베크만 쿨터	4E+05		아니요
원심분리기 5424R	에펜도르프	5E+09		예
원심분리기 5702	에펜도르프	6E+09		예
원심분리기 메가푸지 40R	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	8E+07		아니요
컨센트레이터 플러스	에펜도르프	5E+09	원심 증발기	아니요
형광 실체 현미경 M165 FC	라이카		Planapo 2.0x 대물렌즈 포함	아니요
해부 현미경	라이카		라이카 S6E	예
고배율 현미경 Zeiss Axio Observer Z1	자이스		PlanAPOCHROMAT 20x 대물렌즈 및 Zeiss Axio Cam MRm 사용	아니요
소프트웨어				아니요
이미지 분석 소프트웨어	이미지J			아니요
질량 분석 데이터 분석	단백질 프로스펙터		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	아니요
대장균 균주
오피50	CGC (영어)
RNAi 박테리아
엘4440	Julie Ahringer RNAi 라이브러리
C. 예쁜꼬마선충 돌연변이
CF2253	CGC, 균주 이름: EJ1158		유전자형: gon-2(q388)
C. elegans 형질전환
DCD214	DZNE 튀빙겐의 Della David의 연구실		유전자형: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	DZNE 튀빙겐의 Della David의 연구실		유전자형: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

년 년 호 )