Four-Way Olfactometer Assay: 초파리에서 냄새 유발 반응을 평가하는 방법

초록

출처: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer(4사분면 후각계에서 초파리의 컴퓨터 추적에 의한 후각 행동). J. Vis. 특급 (2016).

초파리는 복잡한 후각 시스템을 가지고 있으며, 수백 가지 냄새 물질을 구별할 수 있으며, 후각을 사용하여 행동 결정을 지시할 수 있습니다. 이 비디오는 파리의 후각 행동 반응을 연구하는 방법인 4방향 후각계 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 테스트 파리를 처리하는 방법과 분석을 수행하는 동안 중요한 단계가 무엇인지 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016)에서 발췌

한 것입니다.

1. 매력적이고 혐오스러운 냄새 물질에 대한 행동 반응

1. 온도 조절기를 켜고 25°C로 설정합니다.
2. 튜브를 부취제 챔버의 배출구와 거동 상자의 Push-to-connect 피팅에 삽입하여 부취 챔버(제어 및 테스트 부취 물질)를 연결합니다.
3. 기류 측정기를 사용하여 각 사분면의 유속을 확인하여 제어 및 냄새 공기 흐름이 100ml/min과 같은지 확인하십시오.
4. PTFE 플라이 아레나와 유리판을 70% 에탄올로 2-3회 청소하고 완전히 자연 건조(~3-4분)합니다.
5. 클램프로 유리판을 경기장에 부착합니다.
6. CO₂ 마취 없이 유리판 중 하나의 구멍을 통해 경기장으로 날아갑니다. 전송 후 파리가 탈출하지 못하도록 구멍에 원형 메쉬를 놓습니다.
   참고: CO₂ 마취는 초파리 행동에 영향을 미치는 것으로 나타났으며 행동 실험 후 24시간 이내에 사용해서는 안 됩니다.
7. 파리가 있는 경기장을 빛이 새지 않는 챔버에 배치하고, 동작 상자의 푸시 연결 피팅에 부착된 튜브를 경기장 모서리에 연결하여 4개의 제어 공기 흐름을 연결하고, 챔버의 문을 닫고 파리가 새로운 환경에 적응할 때까지 10-15분 동안 기다립니다. 가능하면 실험 결과를 편향시킬 수 있는 최소한의 빛 누출을 방지하기 위해 실험이 수행되는 방의 조명을 끄십시오.
8. 파리를 4개의 제어 기류에 노출시키는 5-10분 대조 실험을 실행합니다.
9. 즉시 데이터를 분석하여(아래 데이터 분석 섹션 참조) 파리가 경기장에 균일하게 분포되어 있고 어트랙션 지수가 0에 가까운지 확인하십시오. 이 단계는 경기장 내에서 통제되지 않은 선호 또는 회피 요인(예: 외부에서 새는 빛, 고르지 않은 온도 분포, 고르지 않은 경기장, 악취 오염 등)이 없는지 확인하기 때문에 필수적입니다. 파리가 불균등하게 분포되어 있거나 운동 활동이 낮으면 파리를 버리고 경기장을 다시 청소한 다음(1.4단계) 새 파리 배치를 사용하여 실험을 반복합니다.
10. 3방향 밸브를 켜거나 커넥터 튜브를 다시 연결하여 테스트 냄새 챔버를 설정에 연결합니다.
11. 5-10분 동안 테스트 실험을 실행하고 아래 섹션 2(그림 1)에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 20분 이상 녹음하면 계산적으로 처리하기 어려운 데이터 파일이 생성될 수 있습니다. 더 긴 실험 기록이 필요한 경우 추적 프로그램을 신속하게 중지했다가 다시 시작하십시오. 이로 인해 실험 녹음 사이에 ~10초의 간격이 생깁니다.
12. 파리를 버립니다.
13. 70% 에탄올로 경기장과 유리판을 청소하고(1.4단계) 내광성 인클로저 내의 커넥터 튜브를 교체합니다. 실험을 신속하게 진행하기 위해 새로운 깨끗한 경기장을 사용할 수 있으며, 실험을 수행하는 동안 더러운 경기장을 청소할 수 있습니다.
14. 필요한 경우 새 파리 배치로 다른 실험을 실행합니다. 같은 날에 여러 실험을 실행하는 경우 이전 테스트 실행으로 인한 냄새 물질이 시스템에 남아 있지 않도록 각별히 주의하십시오. 이는 일반적으로 저농도의 냄새 물질이나 CO₂에서는 문제가 되지 않지만, 고농도 자극의 경우 실험 실행 사이에 최대 24시간의 간격이 필요할 수 있습니다. 또한 제어 실험 중 냄새 오염이 의심되는 경우 플로우 튜브 이후의 모든 튜빙을 교체할 수 있습니다. 시스템을 지속적으로 세척하기 위해 실험 사이에 항상 건조한 공기를 켜 두십시오.

2. 데이터 분석

참고: 제안된 비행 추적 획득 소프트웨어(자세한 내용은 자료에 설명되어 있음)는 획득 중에 실시간으로 파리를 추적하고 감지된 모든 파리의 타임스탬프와 좌표를 *.dat 형식으로 저장합니다. 우리는 데이터를 Matlab 형식으로 변환하고 데이터를 분석하기 위해 맞춤형 Matlab 루틴을 개발했습니다. 코드 예제는 보충 자료에 제공되지만 구현에 대한 세부 사항은 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어에 따라 다릅니다.

1. 원시 데이터를 로드합니다. 경기장의 윤곽을 따르는 공간 마스크를 만들고 원시 데이터에 마스크를 적용하여 경기장 밖에 있는 모든 데이터 포인트가 노이즈를 나타내므로 제거합니다(그림 2A, 보조 코드 MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. 0.163cm/s 미만의 속도로 3초보다 오래 이동하는 모든 데이터 점은 잡음이 발생하거나 움직이지 않는 파리에 의해 생성될 가능성이 있으므로 제거합니다(그림 2B, 보충 코드 TemporalFiltering.m).
3. 나머지 데이터 포인트를 한 번에 모두 플로팅하거나 단일 궤적으로 시각화합니다(그림 1, 보충 코드 SingleTrajectoryViewer.m).
   참고: 4개 필드에서의 악취 경계의 위치는 각 냄새 물질의 특성 및 사용되는 공기 흐름 속도와 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 휘발성이 높은 냄새 물질은 휘발성이 낮은 냄새 물질보다 냄새 사분면을 더 완전히 채울 수 있습니다. 따라서 각 냄새 물질은 약간 다른 냄새 경계를 나타낼 수 있습니다. 악취 경계를 측정하기 위해 광이온화 검출기를 사용하는 것은 진공을 사용하여 특정 지점에서 공기를 샘플링하여 해당 지점의 냄새 농도를 방해하기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 냄새 경계는 파리 행동 데이터를 기반으로 빠르게 추정할 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 악취에 대한 반응으로 누적된 파리 발자국을 기반으로 하는 악취 경계는 그림 1C 및 1D에서 명확하게 관찰할 수 있습니다.
4. 인력 지수를 계산하여 대조군 실험이 선호 반응을 생성하지 않는지 여부를 확인하고 냄새 물질(또는 광유전) 자극에 대한 반응에 액세스합니다. 어트랙션 인덱스(AI)를 계산하려면 컨트롤 또는 테스트 기록의 마지막 5분을 사용합니다. +1(절대 인력)과 -1(절대 반발력) 사이에 있는 인력 측정값을 얻으려면 다음 공식을 사용하여 AI를 계산합니다.
   
   여기서 N_test는 테스트 사분면의 데이터 포인트 수이고 N_control은 세 개의 제어 사분면에 있는 데이터 포인트의 평균 수입니다. 이 측정은 0에 가까운 값으로 선호도가 표시되지 않기 때문에 직관적입니다. 그러나 냄새 사분면에 위치한 파리의 총 수에 대한 비율을 정확하게 나타내지는 않습니다. 이 측정값을 얻기 위해 백분율 인덱스(PI)를 사용할 수 있습니다.
   
   여기서 N_test는 테스트 사분면의 데이터 포인트 수이고 _{N total}은 4개의 사분면 모두에 있는 총 데이터 포인트 수입니다. 이 수식은 0과 1 사이에 속하는 측정값을 제공하며, 0.25는 행동 선호가 없음을 나타냅니다(그림 1E 및 2C, Supplementary Code AttractionIndex.m).
5. 각 반복에 대해 새로운 파리 그룹을 사용하여 각 실험 조건에 대해 5-10회 반복을 실행합니다. Kolmogorov-Smirnov 비모수적 테스트(그림 1F, Matlab의 kstest2 함수)를 사용하여 조건 간 또는 제어와 인력 인덱스를 비교합니다.

결과

그림 1: 4-field Olfactory Assay를 사용하여 생성된 예시 데이터. (A) 4개 필드 경기장의 개략도. (B) 4개의 사분면 모두에 건조한 공기 관류만 포함될 때 중립 반응이 관찰됩니다. (C) 왼쪽 상부 사분면에서 관류된 6.25% 희석된 사과 사이다 식초에 대한 인력 반응. (D) 10% 에틸 프로피오네이트에 의해 유발되는 반발 행동. 그림 2B-2D에서는 수집된 데이터의 단일 궤적이 표시됩니다. 색상 그라데이션은 녹음의 시간 경과를 나타내는 데 사용되며 파란색과 빨간색은 각각 녹음의 시작과 끝입니다. (E) 매력 지수(AI)와 백분율 지수(PI)의 비교. (F

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
공기 전달 시스템			(필요한 수량)
튜빙 및 커넥터
열가소성 NPT(F) 매니폴드	Cole-Parmer, 일리노이주, 미국	R-31522-31	1
육각저감니플(1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5232T314	1
튜빙 (ID:1/8)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5108K43	50 피트
튜빙 (ID:1/16)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	52355K41	100 피트
가시가 있는 관 이음쇠	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5117K71	1 팩
푸쉬-투-커넥트(Push-to-connect) 튜브 피팅	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5779K102	4
가시 튜브 피팅 (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5463K439	1 팩 (10)
가시 튜브 피팅 (1 / 8MNPT-> 1 / 8BF)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5463K438	2 팩 (10)
가시 튜브 피팅 (1 / 8MNPT-> 1 / 16BF)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5463K4	2 팩 (10)
가시 관 이음쇠 (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	5670K84	1
육각 머리 플러그	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	제48335K152	1
공기 압력 조절기, 공기 필터 및 유량계			(필요한 수량)
Labatory 가스 건조 장치	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, 오하이오, 미국	모델: L68-NP-303; 재고 #26840	1
150mm 플로우튜브용 멀티튜브 프레임	Cole-Parmer, 일리노이주, 미국	R03215-30	1
150mm 플로우튜브용 멀티튜브 프레임	Cole-Parmer, 일리노이주, 미국	R03215-76	1
150mm 플로우튜브	Cole-Parmer, 일리노이주, 미국	R-03217-15	9
밸브 카트리지	Cole-Parmer, 일리노이주, 미국	R-03218-72	9
정밀 공기 조절기	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	6162K13	1
Soleniod 밸브	오토메이트 사이언티픽, 버클리, 캘리포니아	02-10나는	4
솔레노이드 밸브 컨트롤러	ValveLink 8.2, Automate Scientific, 버클리, 캘리포니아	1월 18일	1
전자식 유량계	니 웰	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) 및	내쇼날인스트루먼트	NI USB-6009	1
전원 공급 장치	Extech 기기	382200	1
냄새 챔버
폴리 프로필렌 와이드 마우스 항아리 2 온스; 60 ml	날진	562118-0002	실험당 최소 5개가 필요하지만 각 냄새 물질의 각 희석에 대해 별도의 챔버가 필요합니다. 컨테이너 스토어에서 사용 가능, 파트 #635114)
유리 냄새 챔버, 0.25 oz	햇살 병	LB4B	실험당 최소 5개가 필요합니다.
냄새 챔버용 "In" 밸브	Smart Products, Inc., 캘리포니아, 미국	214224PB-0011S000-4074	이 부품 중 1개는 냄새 챔버당 사용되지만 자주 교체해야
냄새 챔버용 "Out" 밸브	Smart Products, Inc., 캘리포니아, 미국	224214PB-0011S000-4074	이 부품 중 1개는 냄새 챔버당 사용되지만 자주 교체해야
O 링	RT Dygert International, 미네소타, 미국	AS568-029 부나-N O-R	1 팩 (100)
플라이 아레나, 카메라 및 행동 상자			(필요한 수량)
동작 및 카메라 상자 재질	Interstate plastics, 캘리포니아, 미국	ABS 블랙 압출 (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 평방 인치
플라이 아레나 및 냄새 챔버 인서트용 테프론, 3/8" 두께, 12" x 12"	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	8545K27	1
유리판, 1/8" 두께, 9" x 9"	McMaster-Carr, 일리노이주, 미국	8476K191	2
듀얼 액션 열전 컨트롤러	WAtronix Inc, 캘리포니아, 미국	DA12V-K-0	1
IR LED 어레이	Advanced Illumination, 미국 버몬트주 로체스터	AL4554-88024, PS24-TL	LED 어레이 2개 및 전원 공급 장치 1개
에어컨 유닛	Melcor 스토어	MAA280T-12	1
이미징 시스템			(필요한 수량)
Cosmicar/Pentax C21211TH(12.5mm F/1.4) C-마운트 렌즈	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, 뉴욕, 미국	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N 상호 연결 케이블	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, 뉴욕, 미국	SOCCXC12P05N	1
DC-700 카메라 어댑터	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, 뉴욕, 미국	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR 필터	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, 뉴욕, 미국	우편번호 65-072442	1
TiFFEN 40.5mm 원형 편광판	아마존		1
IR 비디오 카메라	Industrial Vision Source, 미국 플로리다주	소니 XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB 비디오 컨버터	The Imagingsource, 노스캐롤라이나, 미국	DFG/USB2-잇	1
iFlySpy2 (플라이 추적 소프트웨어)	줄리안 브라운, 캘리포니아 스탠포드: julianrbrown@gmail.com	아이플라이스파이2	1
IC 캡처 소프트웨어	The Imagingsource, 노스캐롤라이나, 미국	(http://www.theimagingsource.com/)
잡다한			(필요한 수량)
Dremel 로터리 공구	Dremel, 라신, 위스콘신, 미국	드레멜 8000-03	1
유리 절단을 위한 다이아몬드 코팅 드릴 비트	다양한 공급업체에서 사용할 수 있습니다. MSC Industrial Supply Co, 멜빌, 뉴욕	90606328	1

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