초파리 Y-maze Assay: 파리의 후각 반응을 평가하는 방법

초록

출처: Simonnet, M. M., et al. Y-maze Assay로 초파리 후각 테스트. J. Vis. 특급 (2014).

이 동영상은 Y-미로라고 하는 초파리의 후각 탐색 행동을 테스트하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 분석을 설정하고 수행하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜 텍스트는 Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014)에서 발췌

한 것입니다.

1. 시작하기 전에

1. 안정적이고 견고한 거동 표현형을 지닌 isogenized reference stock을 사용합니다. 모든 잠재적 대조군은 이질적인 배경 대립유전자를 가질 수 있으므로 이 스톡을 선택하는 데 대한 일반적인 규칙은 없습니다.
2. 이 제어 변형률을 사용하여 이후 단계에 필요한 다른 모든 스톡을 역교차합니다. 이 역교차 단계는 일반적으로 단일 처녀 암컷(상동 염색체 간의 가능한 교차를 허용하기 위해)에서 2-3개의 동종 참조 수컷으로의 최소 5개의 연속적인 교배로 표시됩니다. 이 단계는 서로 다른 파리 주식 간의 유전적 배경을 균질화하는 데 중요합니다.
3. 표준 옥수수 가루(9%), 효모(10%) 및 한천 배지(1.5%)에 항생제(0.4% 메틸 파라-하이드록시-벤조에이트)를 25°C에서 12시간 명암 주기로 유지합니다.
4. 원적외선 아래에서 온도가 조절되는 방(25°C)에서 화학감각 실험을 수행합니다(시각적 신호의 영향을 제거하고 화학감각 신호에 집중하기 위해). 각 실험 사이의 영역을 환기시키기 위해 정기적으로 실내 공기를 갱신하십시오.

2. Y-maze Assay를 사용한 후각 반응

1. 테스트하기 전에 젖은 종이 타월이 들어있는 유리관에 25 ° C에서 16-18 시간 동안 파리를 굶어 죽입니다.
2. Y자형 커넥터를 두 개의 유리 바이알과 더 작은 플라스틱 바이알(로딩 바이알)에 연결합니다. 폼 스토퍼를 통과하는 1ml 피펫 팁을 사용하여 커넥터를 3개의 바이알에 연결하고 단단히 밀봉된 Y-미로를 얻습니다. 두 개의 피펫 팁(결정을 내린 후 파리가 다시 돌아오지 않도록 직경 ~2mm)의 좁은 끝을 잘라 두 개의 "트랩" 바이알을 만들고 한 피펫 팁의 큰 끝을 잘라 "로딩" 튜브를 형성합니다(그림 1A).
3. "트랩" 바이알(그림 1 B)을 연결하기 직전에 각 바이알에 직경 ~6mm의 여과지를 하나씩 놓습니다. 한 여과지에 40μl의 냄새 용액을 추가하고 두 번째 여과지에 40μl의 해당 용매를 추가합니다.
4. 4-9일 된 파리 10마리를 "로딩" 바이알에 넣습니다. 이 이송 중에는 CO₂ 마취를 사용하지 마십시오., 행동에 강한 영향을 미치므로 . 차라리 얼음 위에서 잠시 냉각을 사용하십시오. 마취된 파리를 적절하게 조작하는 것은 피험자에 대한 스트레스를 가능한 한 제한하는 데 중요합니다.
   1. 시각적 자극을 최대한 피하기 위해 25°C에서 원적외선(LED 전구를 사용하여 가능한 열원을 제한) 아래에서 일련의 Y-미로 테스트를 수행합니다. Y-미로의 방향을 번갈아 가며 주의하십시오(냄새 물질은 튜브를 함유한 튜브가 왼쪽 또는 오른쪽에 있고 로딩 튜브는 앞이나 뒤에 있습니다. 그림 1C).
   2. 파리가 냄새 물질이나 용제가 들어 있는 트랩 바이알에 들어갈 때까지 몇 시간 동안 기다립니다. 24시간 이후 카운트 플라이를 통해 참여도를 최대 80% 이상까지 높이고 최대 후각 지수 값(Simonnet, 개인 커뮤니케이션)을 제공합니다.
   3. 다음 공식을 사용하여 결과 후각 지수를 계산합니다: (냄새 튜브의 숫자 - 용매 튜브의 숫자)/적재된 파리의 총 수.
5. 다음과 같이 Y-미로 설정을 세척합니다: 분해된 설정을 RBS 35 MD에 밤새 담그십시오. 수돗물로 철저히 헹굽니다. 마지막으로 탈이온수로 헹구고 말리십시오.

3. 데이터 통계 분석

1. 데이터와 변수에 따라 t-검정, 일원 분산 분석 또는 이중 분산 분석을 수행합니다.

결과

그림 1: Y-미로 설정으로 평가한 남성의 후각 반응. A) 분할 장치. B) 조립 장치. C) 원적외선에서 작동 상태로 설정합니다. D) 증류수(10% v/v)에 희석된 아세트산(AA) 또는 페닐아세트산(PAA)에 대한 남성 후각 반응의 정량화(N = 11, 총 110마리의 파리를 나타냄). 통계 분석은 데이터를 0과 비교하는 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 0은 선호 사항이 없음을 의미합니다. 음수 값은 냄새 물질에 대한 혐오감을 나타내고 양수 값은 인력을 나타냅니다. : p < 0.0001; ns: 유의하지 않음(p = 0.1680).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
초파리 폴리스티렌 튜브	VWR 유럽	Tel.: 734-2255	30 x 25mm Y-미로
초파리 붕규산 튜브	디종 베레		95 X 25mm Y- 미로
폼 스토퍼	더처	999038	Y-미로
Y자형 커넥터	유로프리	11020605	Y-미로
100-1,000 μl 피펫 팁	코 닝	4868	다음 피펫 팁을 Y자형 커넥터에 결합하십시오. 넓은 끝에서 65mm 떨어진 곳에서 2개의 피펫 팁을 자르고 좁은 끝(~2mm 개구부 포함)을 2개의 테스트 바이알에 연결합니다. 이 구멍은 파리가 냄새가 나는 튜브에 들어가면 U턴을 제한합니다. 파이펫 팁 1개를 넓은 끝에서 35mm 크기로 잘라 로딩 바이알에 연결합니다.
근적외선 LED 전구	루빈-라카크	0RB180238	625-630 nm 수치
아세트산	시그마-알드리치	45725
페닐아세트산	시그마-알드리치	P16621
효모	Sensient Flavors 스트라스부르	1018880464
옥수수 가루	유로세균	파리네 드 마이스
한천	칼리스	HP-697-25
메틸 하이드록시 4 벤조에이트	VWR 국제	25605293

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