살아있는 초파리 배아의 미세주입: 발달 중인 배아에 시약의 조기 전달

초록

출처: Brust-Mascher, I., Scholey, JM Drosophila melanogaster Syncytial Embryo에서 유사분열 연구를 위한 미세 주입 기술. J. Vis. 특급 (2009).

이 동영상은 살아있는 초파리 배아에 시약을 전달하는 미세주입을 수행하는 방법을 설명합니다. 연구자들은 이 방법을 사용하여 배아 발달의 초기 단계에서 핵산 및 단백질과 같은 외인성 화합물을 도입할 수 있습니다. 주요 프로토콜은 모든 용해성 시약(여기서는 라이브 이미징 실험을 위한 형광 단백질)의 주입 절차를 설정하고 수행하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Brust-Mascher and Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo에서 발췌한 것입니다, J. Vis. Exp. (2009).

조리법:

포도 주스 플레이트:

• 바토 한천 5.5g

• 포도당 또는 포도당 14.5g

• 자당 7.15g

• 포도 주스 농축액 45ml(100% 주스).

• 204.5 ml H₂0

• 625 μl 10N NaOH

모든 재료를 섞고 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다.
2.8ml 산 혼합물 추가 (산 혼합물 : 20.9 ml 프로피온산, 2.1 ml 인산, 27 ml H₂0)

35mm 페트리 접시에 섞어 붓습니다. 실온에서 하루나 이틀 동안 굳히십시오. 플레이트를 곧 사용하지 않을 경우 파라필름으로 밀봉하고 4°C로 유지하십시오(사용하기 전에 RT로 평형을 유지).

효모 페이스트:
효모(Sigma YSC2, Saccharomyces cerevisiae type II의 효모) 약 1작은술을 물에 녹여 걸쭉한 페이스트를 만듭니다. 사용 직전에 각 포도 주스 접시에 소량을 넣으십시오.

주입 버퍼:

• 150mM K-아스파르테이트

• 10mM K-인산염

• 20mM 이미다졸, pH 7.2

헵탄 접착제:
이중 접착 테이프를 펴서 100ml 병에 넣고 헵탄 50ml 정도를 넣고 병을 밀봉하고 며칠 동안 흔듭니다. 사용할 때 접착제가 너무 두꺼우면 헵탄을 첨가하십시오.

탈수실:
100mm 페트리 접시를 가져 와서 35mm 접시의 한 부분을 안에 넣어 "테이블"을 만들고 그 주위에 드리 어라이트(무수 황산 칼슘)를 추가하여 드리어라이트의 높이가 "테이블"과 덮개보다 높지 않도록 합니다. 배아가 있는 커버슬립은 주사 전 탈수를 위해 이 "테이블"에 놓일 것입니다. 적어도 일부를 나타내는 Drierite를 사용하고 색상이 변경되면 변경하는 것이 좋습니다.

프로토콜 :
이 프로토콜은 초파리 세포융합 배아(Drosophila syncytial embryo)에 거의 모든 용해성 시약을 주입하는 데 사용할 수 있습니다: 예를 들어, 관찰을 위한 형광 단백질 또는 표적 단백질 억제제 또는 둘 다.

1. 배아 수집

1. 레이 케이지에 새 포도 주스 접시를 놓습니다.
2. 1 시간 후에이 플레이트를 제거하면, 이것은 하루의 첫 번째 수집이며 종종별로 좋지 않습니다. 버릴 수 있습니다.
3. 한 시간마다 플레이트를 교체하여 각각 한 시간씩 배아를 계속 수집합니다.

2. 커버슬립 준비

1. 현미경 슬라이드의 한쪽 면에 50 x 22mm 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드가 움직이지 않도록 네 모서리를 슬라이드에 테이프로 붙입니다.
2. 면봉 어플리케이터를 사용하여 커버슬립에 헵탄 접착제 한 층을 한 줄로 놓습니다(접착제는 점성이 없어야 하며 몇 초 안에 건조되어야 합니다. 그렇지 않으면 헵탄을 더 추가합니다).
3. 커버슬립 옆쪽으로 슬라이드에 이중 접착 테이프를 붙입니다.

3. 배아 준비

참고: 배아는 채취 시작 후 약 2시간 후에 이미지화해야 하므로 이 기간 내에 배아를 완료할 수 있는 충분한 시간을 두고 다음 단계를 시작하십시오.

1. 물에 적신 브러시로 포도 주스 플레이트에서 배아를 조심스럽게 집어 슬라이드의 이중 접착 테이프에 놓습니다.
2. 핀셋의 바깥쪽 부분을 사용하여 융모막(바깥쪽 막)이 부서질 때까지 이중 접착 테이프 위에 배아를 굴립니다.
3. 배아를 융모막 위로 부드럽게 굴려 핀셋에 달라붙도록 하여 배아를 집어 올리고 배아의 긴 면이 커버슬립의 긴 면과 평행이 되도록 커버슬립의 헵탄 접착제 위에 놓습니다. 한 줄에 10-20개의 배아를 설정합니다.
4. 커버 슬립을 제거하고 3-8 분 동안 탈수 챔버에 놓습니다 (이는 방의 습도와 주입 할 양에 따라 다름).
5. 진공 그리스가 있는 금속 챔버에 놓습니다.
6. 추가 탈수를 방지하기 위해 배아를 할로카본 오일 700으로 덮습니다. 이제 배아를 주입할 준비가 되었습니다.

4. 배아 주입

1. 16x 대물렌즈 아래에서 배아를 찾습니다.
2. 배아를 멀리 옮기고, 초점면을 움직이지 않고 바늘을 찾는다.
3. 바늘을 중앙에 놓고 x 또는 y 방향으로 움직이지 않고 위로 움직입니다.
4. 바늘이 열려 있지 않으면 커버슬립의 가장자리를 시야에 놓되 바늘이 있을 위치가 아닌 바늘을 동일한 초점면으로 내립니다. 커버 슬립이 바늘에 닿을 때까지 매우 조심스럽게 움직여 부드럽게 부수십시오. 바늘이 열려 있으면 5단계로 이동합니다. (바늘은 채우기 전에 불산으로 열 수 있습니다).
5. 배아를 시야에 넣고(바늘이 있을 위치는 아님) 바늘을 기름 속으로 내리고 바늘에서 좋은 액체 방울을 얻을 수 있는지 확인하십시오.
6. 조심스럽지만 꾸준히 배아를 바늘 안으로 옮기고 배아에 한 방울을 주입하여 배아를 멀리 이동시킵니다. (또는 주사 장치의 지침을 따르십시오).
7. 모든 배아를 주입한 후 컨포칼 현미경으로 관찰할 준비가 됩니다.