광점 분석: 초파리 광전술 거동을 조사하는 방법

초록

출처: Sun, Y., et al. Drosophila larval phototaxis 분석을 위한 광점 기반 분석. J. Vis. 특급 (2019).

초파리 유충은 빛에 민감하고 주변 빛의 변화에 반응합니다. 이 동영상은 광점 분석이라고 하는 빛을 피하는 능력을 테스트하는 분석에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 청색광 LED로 분석을 설정하는 방법과 빛과의 만남에 대한 동물의 행동을 기록하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜 텍스트는 Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.에서 발췌한 것입니다.(2019).

1. 이미징 시스템 설정

1. 고해상도 웹 카메라를 바탕 화면의 광점보다 약 10cm 높은 곳에 철 클립으로 고정합니다(그림 1).
2. 카메라 렌즈의 방향을 바탕 화면으로 조정합니다.USB 인터페이스를 통해 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
3. 카메라 바로 아래 바탕 화면에 한천 플레이트를 놓습니다.
4. Windows 7이 설치된 컴퓨터에서 "Amcap9.22" 소프트웨어를 열면 광점이 AMcap 창에 자동으로 표시됩니다. 카메라를 약간 왼쪽이나 오른쪽으로 움직여 광점이 창 중앙 근처에 오도록 합니다. 카메라가 빛의 경로를 차단하지 않는지 확인하십시오. 광점은 완전하고 둥글어야 합니다.
   참고: 소프트웨어는 http://amcap.en.softonic.com/ 에서 찾을 수 있습니다.
5. 카메라 바로 아래 5-7mm에 클립으로 850nm ± 3nm 대역 통과 필터를 고정합니다.
   참고: 필터의 직경은 약 2.5cm이고 카메라 렌즈의 직경은 1cm 미만이므로 필터가 카메라의 시야를 커버할 수 있습니다. 카메라 아래의 필터를 사용하면 AMcap 창에서 광점이 보이지 않아야 합니다.
6. 3개의 적외선 생성 LED(중심 파장 = 850nm)를 한천 플레이트 주위에 고르게 배치합니다. 각 LED는 한천 플레이트의 가장자리에서 약 5cm 떨어져 있어야 하며 LED의 렌즈 면은 한천 플레이트를 향해 아래쪽으로 70° 각도를 유지해야 합니다. AC-DC 컨버터를 통해 LED를 전원에 연결합니다.
   참고: 다양한 실험 시험에서 필드 밝기의 일관성을 보장하고 나중에 비디오 처리를 용이하게 하기 위해 적외선 LED의 위치와 각도를 고정하는 것이 좋습니다.
7. 컴퓨터와 장치 사이에 칠판을 놓습니다. 컴퓨터 화면 조명이 실험에 영향을 미치지 않도록 컴퓨터 화면의 밝기를 낮춥니다.
   참고: 빛의 파장이나 강도를 측정할 때 환경을 어둡게 유지하십시오.

2. 이미징 매개 변수 설정

1. AMcap 소프트웨어의 메뉴에서 Options(옵션) | 비디오 장치 | 캡처 형식을 선택하고 캡처된 비디오의 픽셀 크기를 800 x 600으로, 프레임 속도를 60fps로 설정합니다.
2. 카메라 아래에서 필터를 제거하고 카메라 아래에 자를 놓고 카메라 초점을 조정하여 눈금 선을 선명하고 비디오 시야의 너비와 평행하게 만듭니다.
3. 캡처 | 설정 | 비디오 캡처를 클릭하여 저장 경로를 선택하고 녹화 시작을 클릭하고 600픽셀에 해당하는 실제 거리를 기록하고 실제 거리에 대한 각 픽셀의 비율을 계산합니다.

3. 빛 회피 행동의 비디오 녹화

1. 모든 실험에서 25.5°C의 온도를 유지하십시오. 필요한 경우 에어컨으로 실내 온도를 조절하십시오. 가습기로 습도를 60%로 일정하게 유지하십시오.
2. "lightarea1"이라는 광점 위치에 대한 짧은 비디오를 촬영합니다. 그런 다음 850nm ± 3nm 필터를 다시 이동하여 카메라 렌즈를 덮습니다.
   참고: 유충 행동을 기록할 때 카메라 렌즈는 850nm ± 3nm 필터로 덮여 있어 광점이 비디오에 표시되지 않습니다. 광점은 나중에 Matlab을 사용하여 유충이 있는 비디오로 재구성할 수 있습니다. 카메라의 위치를 변경하지 말고 2.3단계에서 측정한 실제 거리에 대한 각 픽셀의 비율을 변경하지 마십시오.
3. 실험 장치에서 멀리 떨어진 조명(즉, 실내 조명)을 켭니다. 유충이 눈으로 명확하게 보일 수 있는 한 빛을 가능한 한 낮게 줄이십시오. 숟가락으로 배양 배지에서 유충을 꺼내고 세 번째 instar 유충을 부드럽게 선택하고 증류수로 깨끗이 씻습니다. 배고픔의 방해를 피하기 위해 유충을 한 번에 하나씩 씻도록 주의하십시오. 한 번의 실험에는 최소 20마리의 유충이 필요합니다.
4. 1.3단계에서 유충을 카메라 아래에 배치된 한천 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 브러시로 유충의 과도한 수분을 부드럽게 제거하거나 압지를 사용하여 유충의 수분을 제거하여 렌즈 아래에서 빛이 반사되는 것을 방지합니다. 실내 조명을 끄고 유충이 어두운 환경에서 2분 동안 적응하도록 합니다.
5. LED 조명을 켜서 적외선을 생성하고 유충을 접시 중앙으로 부드럽게 빗질합니다. 유충이 똑바로 기어 다니기 시작하면 플레이트를 회전시켜 유충이 밝은 점으로 향하도록 합니다. 처음부터 바로 기어 다니는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 밝은 점에 접근하지 못할 수 있습니다.
6. 캡처 | 설정 | Video capture(비디오 캡처)를 클릭하여 저장 경로를 선택한 다음 Start recording(녹화 시작)을 클릭하여 녹화합니다. 유충이 밝은 점을 향해 기어가도록 하고 밝은 점에 들어간 다음 시야에서 거의 벗어날 때까지 밝은 지점을 떠나십시오. 기록 중지를 클릭합니다. 유충이 가까이 다가가기 전에 밝은 지점에서 멀어지면 녹화 중지를 직접 클릭합니다.
7. 필터를 카메라에서 멀리 옮깁니다. "lightarea2"라는 이름의 광점 위치에 대한 짧은 비디오를 찍고 "lightarea1"과 비교하여 광점 위치가 변경되지 않았는지 확인합니다. 명백한 위치 변경이 관찰되면 데이터를 버리십시오.

결과

그림 1: 실험 설정. (A) 광점 기반 유충 빠른 phototaxis 분석을 위한 설정의 개략도. 파란색 선은 시각적 자극으로 사용되는 가시광선의 경로를 나타내고 빨간색 선은 적외선의 경로를 나타냅니다. 화살표는 빛의 방향을 나타냅니다. 850nm 대역 통과 필터는 적외선은 통과시키지만 가시광선은 차단합니다. (B) 광점 분석을 위한 설정 이미지. 이미지는 더 나은 시각화를 위해 밝은 조건에서 촬영되었다는 점에 유의해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
850nm ± 3nm 적외선 생성 LED	Thorlabs, 미국	미세먼지100A	호환 가능한 센서: 포토다이오드 및 Thermal 광 출력 범위a: 100pW - 200W 사용 가능한 센서 파장 범위 : 185 nm-25 μm 디스플레이 재생률 : 20 Hz 대역폭: DC-100 kHz 포토다이오드 센서 범위b: 50nA-5mA 열전퇴 센서 범위b: 1 mV-1 V
AC-DC 컨버터	Thorlabs, 미국	S120VC	조리개 크기 : Ø9.5 mm 파장 범위 : 200-1100 nm 전력 범위: 50nW-50mW 검출기 유형: Si 포토다이오드(UV 확장) 선형성 : ±0.5 % 측정 불확도: ±3%(440-980nm), ±5%(280-439nm), ±7%(200-279nm, 981-1100nm)
대역 통과 필터	Thorlabs, 미국	DC2100	LED 전류 범위: 0-2 A LED 전류 분해능: 1mA LED 전류 정확도: ±20mA LED 순방향 전압: 24 V 변조 주파수 범위: 0-100kHz 사인파 변조 : 임의
시준 LED 블루라이트	ELP, 중국	USBFHD01M	최대 해상도: 1920x1080 F6.0 mm 센서 : 1 / 2.7 "CMOS OV2710
소형 파워미터 콘솔	Ocean Optics, 미국	USB2000+(라드)	치수: 89.1mm x 63.3mm x 34.4mm 무게 : 190 g 검출기: Sony ILX511B(2048요소 선형 실리콘 CCD 어레이) 파장 범위 : 200-850 nm 통합 시간: 1ms – 65초(일반 20초) 다이내믹 레인지: 8.5 x 10^7(시스템); 단일 수집의 경우 1300:1 신호 대 잡음비 : 250 : 1 (전체 신호) 다크 노이즈 : 50 RMS 카운트 격자 : 2 (250 – 800 nm) 슬릿 : SLIT-50 검출기 수집 렌즈 : L2 주문 정렬: OFLV-200-850 광학 해상도 : ~ 2.0 nm FWHM 미광: 600nm에서 <0.05%; 435 nm 에서 <0.10% 광섬유 커넥터: SMA 905 - 0.22 개구 단일 가닥 광섬유
고전력 LED 구동기	Minhongshi, 중국	MHS-48XY	작동 전압 : DC12V 중심 파장 : 850nm
고해상도 웹 카메라	Thorlabs, 미국	MWWHL4	색상: Warm White 상관 색온도 : 3000 K 일반 LED 전원에 대한 테스트 전류: 1000mA 최대 전류 (CW) : 1000 mA 대역폭(FWHM): N/A 전력 : 3000 mW 시야각 (전체 각도) : 120 ° 이미터 크기: 1mm x 1mm 일반적인 수명: >50 000 h 작동 온도 (비 응축) : 0-40 ° C 보관 온도 : -40 - 70 °C 위험 그룹a: RG1 – 저위험군
LED 웜 화이트	Mega-9, 중국	BP850/22케이	Ø25.4(+0~-0.1) mm 대역폭 : 22±3nm 최고 투과율:80% 중심 파장 : 850nm±3nm
분광기	노엘 단주	암캡9.22	AMCap은 고급 미리보기 및 녹화 기능을 갖춘 스틸 및 비디오 캡처 응용 프로그램입니다. Windows 7 SP1 이상을 실행하는 컴퓨터용으로 설계된 데스크톱 응용 프로그램입니다. 대부분의 Windows용 비디오 및 DirectShow 호환 장치는 저렴한 웹캠이든 고급 비디오 캡처 카드이든 관계없이 지원됩니다.
표준 포토다이오드 파워 센서	슈퍼 드래곤, 중국	YGY-122000	입력 : AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0.8A 출력: DC 12V 2A
열 전력 센서	Thorlabs, 미국	M470L3-C1	색상: Blue 공칭 파장 a : 470 nm 대역폭(FWHM): 25 nm 최대 전류 (CW) : 1000 mA 순방향 전압: 3.2 V 전력 (최대) : 3200 mW 이미터 크기: 1mm x 1mm 일반적인 수명: 100 000 h 작동 온도 (비 응축) : 0-40 ° C 보관 온도 : -40 - 70 °C 위험 그룹b: RG2 – 중간 위험 그룹
열 전력 센서	Thorlabs, 미국	S401C	파장 범위 : 190 nm-20 μm 광 출력 범위 : 10 μW-1 W (3 Wb) 입력 조리개 크기: Ø10mm 활성 검출기 영역: 10mm x 10mm 최대 광 전력 밀도: 500W/cm2(평균) 선형성: ±0.5%

시리즈 시리즈