유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

초록

출처: Imura, E., et al. 초파리 초파리 멜라노가스터에서 면역염색을 통한 스테로이드성 장기 및 상호 작용 기관을 시각화하기 위한 프로토콜. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 생합성과 엑디스테로이드 및 기타 호르몬 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조인 초파리 고리샘에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 염색을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌한 것입니다.

참고: 프로토콜의 전체 체계는 그림 1.

1. 유충 고리 땀샘(RG)의 해부

참고: cyclorrhaphous Diptera에 속하는 D. melanogaster에서 PG는 고리샘(RG, 그림 2 D)이라고 하는 복합 내분비 기관 내에 있습니다. PG를 다른 유형의 세포와 외과적으로 분리하는 것은 불가능하기 때문에(나중에 논의) 실용적인 목표는 손상되지 않은 손상되지 않은 RG를 해부하여 분리하는 것입니다.

1. 적절한 발달 단계에서 유충의 준비
   참고: D. melanogaster 유충의 발달 단계를 동기화하려면 좁은 시간 창 내에서 알을 수집하고 적절한 시간에 유충을 수집해야 합니다.
   1. 2 ° C의 포도 주스 한천 플레이트에 25 시간 동안 계란을 모으십시오.
   2. 집게가 있는 해부 현미경으로 새로 부화한^1st instar 유충을 모아 으깬 표준 효모/옥수수 가루 파리 먹이가 들어 있는 작은 바이알로 옮깁니다.
      참고: 유충의 나이는 "알을 낳은 후 몇 시간(hAEL)", "부화 후 시간(hAH)" 또는 "L3 탈포 후 시간(hAL3E)"으로 표시됩니다.
   3. 적절한 시점에, 바람직하지 않은 부상을 방지하기 위해 일회용 플라스틱 고리로 준비된 유충을 수집합니다. 3^번째 인스타 유충의 발달 진행 차이를 최소화하기 위해 2^{번째 인스타} 유충을 70hAEL(48hAH)로 수집하고 2시간 간격으로 털갈이를 하도록 합니다. 그런 다음 L3 탈진 후 2시간 이내에 3^번째 instar 유충을 수집합니다. 이 절차는 0-2 hAL3E 유충을 제공합니다.
   4. 단계화된 유충을 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 접시에 옮깁니다.
   5. PBS로 유충을 헹구어 몸에 남아 있는 음식물을 제거합니다.
2. 해부 현미경으로 유충을 거칠게 해부
   1. 집게로 유충의 입 고리를 잡습니다. 마이크로 가위를 사용하여 몸 길이의 앞쪽 1/3에서 유충 몸을 절단합니다.
   2. 앞쪽 유충 몸체의 절단된 끝을 한 쌍의 집게로 잡습니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 머리 끝을 몸 안쪽으로 부드럽게 밉니다. 이 절차는 유충의 몸을 뒤집어 놓습니다.
      참고: 이 단계는 1st instar 유충의 해부를 위해 건너뛸 수 있습니다.
   3. 추가 유충으로 1.2.1-1.2.2 단계를 5-10 분 동안 반복합니다
      참고: 유충의 수는 해부 시간을 절약하기 위해 20 이하여야 합니다.
3. 면역조직화학을 통한 조직의 고정 및 염색
   1. 유충 몸체의 앞쪽 1/3(단계 1.2.2)을 500μL 고정 용액(PBS의 4% 파라포름알데히드)으로 채워진 1.5mL 마이크로튜브에 넣습니다. 한 번에 20개 미만의 시료를 수정하고, 그렇지 않으면 고정 시료에 부착된 PBS로 인해 정착제가 바람직하지 않게 희석될 수 있습니다. 필렛 해부의 경우 PBS 한 방울을 제거한 다음 fix solution.
      한 방울을 추가합니다. 참고: 고정 용액의 경우 3.7% 포름알데히드 또는 4% 파라포름알데히드를 사용할 수 있습니다.
   2. 절개된 조직을 fix solution에 실온(RT)에서 30분 동안 또는 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   3. 고정 용액을 500μL PBS로 교체하고 샘플을 3회 빠르게 헹굽니다. RT의 로커에서 500μL 0.3% PBT(PBS + 0.3% 옥틸페놀 에톡실레이트)로 샘플을 15분 동안 세척합니다. 필렛 해부의 경우 곤충 핀을 제거하고 샘플을 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
      참고: 조직으로의 항체 투과성을 증가시키기 위해 샘플은 RT의 로커에서 1-2시간 동안 500μL 2.0% PBT로 처리됩니다.
   4. PBT를 500μL 차단 용액(PBT 내 2% 소 혈청 알부민)으로 대체합니다. RT의 로커에서 샘플을 1.5시간 동안 배양합니다.
   5. 차단 용액을 50μL의 기본 항체 용액, 즉 차단 용액에 희석된 항체로 교체합니다.
   6. 샘플을 4°C의 로커에서 밤새 배양합니다.
   7. 1차 항체 용액을 500μL 0.3% PBT로 교체하고 샘플을 5회 빠르게 헹굽니다. RT에서 로커에서 각각 15분 동안 500μL 0.3% PBT로 샘플을 3회 세척합니다.
   8. 0.3% PBT를 50μL의 2차 항체 용액(차단 용액에 희석된 염료 결합 항체)으로 대체합니다. 핵 염색의 경우 50μL 용액에 0.5μL 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 0.1mg/mL 원액)을 첨가합니다. 로커에서 샘플을 상온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 샘플을 어두운 곳에 보관하십시오.
   9. 항체 용액을 500μL 0.3% PBT로 교체하고 5회 헹굽니다. RT에서 각각 15분 동안 500μL 0.3% PBT로 샘플을 3회 세척합니다.
4. PG를 포함하는 뇌-RG 복합체의 미세 해부 및 장착
   1. 일회용 피펫을 사용하여 면역 염색된 샘플을 0.3% PBT.
      로 채워진 접시에 옮깁니다. 참고: 해부 및 장착 시 불편한 기포를 방지하기 위해 0.3% PBT를 PBS로 대체할 수 있습니다.
   2. 해부 현미경 아래에서 한 쌍의 집게로 큐티클 또는 입 고리를 잡습니다. 1mL 주사기에 부착된 27G 바늘을 "칼"로 사용하여 식도와 안구 디스크의 앞쪽 끝을 잘라 신체 큐티클에서 뇌-RG-눈 디스크 복합체를 제거합니다.
   3. 집게로 식도와 장을 뇌-RG-눈 디스크 복합체에서 분리합니다. 식도는 복부 신경삭(VNC) 위의 뇌를 통과하기 때문에 장을 뒤쪽으로 빼냅니다.
      참고: 샘플에서 여분의 상상 디스크를 제거하려면 바늘 칼로 뇌, 안구 디스크 및 다리 디스크 사이의 연결을 절단합니다.
   4. 다른 샘플에 대해 1.4.1-1.4.4 단계를 반복합니다.
      참고: 조직 파편이 샘플에 달라붙는 것을 방지하기 위해 완성된 각 샘플을 0.3% PBT 또는 PBS로 채워진 다른 깨끗한 접시에 옮깁니다.
   5. 마이크로피펫을 사용하여 샘플을 깨끗한 유리 슬라이드의 중앙으로 옮깁니다.
      참고: 2^차 또는 3^차 인스타 유충의 경우 마이크로피펫 끝의 끝을 면도날로 잘라야 합니다.
   6. 해부 현미경 아래에서 forceps.
      를 사용하여 개별 샘플을 등쪽이 위로 향하도록 정렬합니다. 참고: 망막은 뇌의 등쪽에 위치합니다(그림 2A). 이러한 정렬은 이미징 중 개별 샘플의 사양을 용이하게 합니다.
   7. 유리 슬라이드를 기울여 과도한 PBT를 최대한 닦아냅니다. 슬라이드 측면에 장착 시약을 한 방울 떨어뜨립니다. 방울의 반대쪽에서 커버 슬립의 가장자리를 놓고 집게로 천천히 샘플에 커버 슬립을 놓습니다.
      참고: 이 절차는 샘플이 커버 슬립 밖으로 이동하는 것을 방지합니다.
   8. 샘플을 4°C에서 보관하십시오. 샘플을 어두운 곳에 보관하십시오.

결과

그림 1: 프로토콜의 전체 체계. 실험의 목적에 따라 유충과 성체 암컷에 두 가지 뚜렷한 해부 방법이 적용됩니다. 장착 방법도 샘플 조건에 따라 고안됩니다. 고정, 염색 및 이미징 기술은 기본적으로 모든 샘플에 공통적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PG와 PG 투영 뉴런의 시각화. (A 및

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
난자 수집
조직 배양 접시 (55mm)	하나로	1-8549-02	포도 주스 한천 플레이트용
제품분류 컵	히카리 가가쿠
효모 페이스트	동양 건조 효모, 도쿄
100% 포도 주스	웰치 푸드 Inc.
유충 사육
소형 바이알(12ml, 40×23.5mm, PS)	사르스테트	58.487
일회용 루프	하나로	6-488-01
표준 플라이 푸드			레시피는 블루밍턴 스톡 센터 웹사이트에 있습니다.
해부
해부 현미경	칼 자이스	스테미 2000-C
해부 현미경	라이카	S8 AP0
조직 배양 접시 (35 x 10mm, 비 처리)	이와키	1000-035
실가드	도레이		접시 안쪽에 Coarting 실리콘
테루모 바늘 (27G, 0.40 x 19mm)	데루모	NN-2719S	조직을 자르는 "칼"
집게, 이녹스, #5	Dumont, 스위스
곤충 핀(직경 0.18mm)	시가 브랜드		필렛 해부용
마이크로 가위	주식회사 나츠메 제작	MB-50-10
고정
초순수	머크 밀리포어
인산염 완충 식염수(PBS)
포름알데히드	나칼라이 테스크	16222-65
파라포름알데히드	나칼라이 테스크	제02890-45
트리톤-X100	나칼라이 테스크	35501-15
마이크로튜브(1.5ml)	이나 옵티카	CF-0150
잠복
1 개의 swist 믹서 TM-300 (로커)	하나로	TM-300	로커
소 세럼 알부민	시그마	9048-46-8
1차 항체
안티 Sro (기니피그), 1:1000
안티 GFP (토끼), 1:1000	분자 프로브	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP(마우스 mAb, GF200), 1:100	나카라이 테스크	제04363-66
안티-5HT (토끼), 1:500	시그마	S5545
anti-Hts 1B1 (마우스)	발달 연구 하이브리도마 은행(DSHB)	1나1호
안티 DE-cadherin (쥐), 1:20	증권 시세	디케이드2
Anti-NC82 (마우스), 1:50	증권 시세	NC82
2차 항체
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate	생명 기술	A-11008
염소 안티-마우스 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate	생명 기술	A-11001
염소 anti-Rat IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 546 conjugate	생명 기술	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555 conjugate	생명 기술	A-21435
Alexa Fluor 546 염료 접합 팔로이딘	생명 기술	A-22283
마운팅 시약
마이크로 슬라이드 유리	Matsunami Glass 공업 주식회사	SS7213
사각 현미경 커버 유리	Matsunami Glass 공업 주식회사	C218181
FluorSave 시약(장착형 시약)	칼바이오켐	345789
전사 피펫 1 ml (일회용 스포이드)	왓슨	5660-222-1초
플라이 스톡(Fly stocks)
승; GMR45C06-갈4			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#46260)
UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP			도쿄 대학의 K. Ito의 선물.
승[1118]
w; 팬텀-GAL4#22/UAS-turboRFP
승; UAS-mCD8::GFP; TRH-갈4			Li, H. H. (2014) 및 Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
승; UAS-mCD8::GFP			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			블루밍턴 초파리 주식 센터에서. (#51941)