국소 열 프로브 분석: 초파리 유충의 고온 통각을 평가하는 방법

초록

출처: Chattopadhyay, A., et al. 초파리 유충의 열 통각을 평가하는 지역 및 글로벌 방법. J. Vis. 특급 (2012).

초파리 유충은 잠재적으로 해로운 열 자극에 대한 반응이 동물의 혐오적 또는 소위 "통각" 행동을 유발하는 전용 감각 뉴런(통각 수용기)을 가지고 있습니다. 이 비디오는 열 프로브를 큐티클에 국부적으로 적용한 것에 대한 반응으로 유충 행동을 기록하여 열 통각을 평가하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 방법을 국소 열 프로브 분석이라고 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012)에서 발췌

한 것입니다.

1. 국부 열 프로브 분석

우리는 Pro-Dev Engineering에서 제조한 맞춤형 열 프로브를 사용하여 개별 유충 신체 세그먼트에 유해한 열 자극을 전달합니다(재료 표 참조). 이 프로브는 최적의 설계 기능(~ .07mm^{, 2} 면적의 작은 금속 팁과 23°C에서 65°C까지 설정 온도를 정확하게 유지할 수 있는 기능)을 가지고 있지만 원칙적으로 최대 20초 동안 정의된 온도로 가열할 수 있는 작은 팁이 있는 모든 도구로 충분합니다. 프로브 팁은 복부 분절 A4의 등쪽 정중선에서 초기 3번째 인스타 유충을 정확하게 자극하는 데 사용됩니다(그림 1 참조). 이 열 자극에 대한 반응으로 유충은 일반적으로 측면으로 360도 이상 구르는 혐오스러운 철수 행동을 보입니다. 이 행동은 일반적으로 운동 활동의 짧은 중지를 포함하는 무해한 실온 금속 프로브에 대한 가벼운 터치 반응과 구별됩니다.

열 프로브 분석을 위한 프로토콜:

1. 열 프로브의 온도를 원하는 설정점으로 사전 설정합니다.
2. 붓이나 집게를 사용하여 개별 유충을 평평한 플랫폼(우리는 일반적으로 바인더에서 자른 작은 비닐 조각을 사용함)으로 부드럽게 옮기고 이후에 유충을 자극합니다. 유충은 열 프로브와 접촉하기 전에 얇은 물막으로 덮어야 합니다. 유충을 덮고 있는 물막은 가능한 한 적어야 하고 유충을 완전히 덮어야 하며, 비닐을 만질 때 유충이 건조하지 않도록 해야 합니다.
3. 프로브와 유충 표면 사이에 약 45° 각도로 팁으로 가벼운 압력을 가하여 세그먼트 A4의 유충에 대해 프로브 팁을 부드럽게 누릅니다(그림 1 참조). 압력은 유충 표면에 약간의 움푹 들어간 곳을 유발해야 하며 일반적으로 이동을 방지하기에 충분합니다. 유충이 계속 움직이면 약간 더 압력을 가하면 일반적으로 멈춥니다. 시야를 벗어나거나 응답 또는 20초 컷오프까지 지속적인 프로브 접촉을 달성할 수 없는 유충의 데이터를 기록하지 마십시오.
4. 금단 반응이 나타날 때까지 또는 20초 컷오프에 도달할 때까지 중 먼저 발생하는 시점까지 유충을 계속 자극합니다. 반응하는 유충은 일반적으로 머리와 꼬리를 들어 올리는 예비 행동을 먼저 보입니다. 이것은 일반적으로 최소 360도를 굴리는 철수 동작이 뒤따릅니다. 360도의 완전한 굴림만이 통풍 행동으로 점수가 매겨집니다(예비 머리 또는 꼬리 올리기는 그렇지 않습니다).
5. 인출 동작이 시작되면 프로브와의 접촉을 해제하고 대기 시간 또는 인출 시간을 기록합니다. 20초 이내에 금단 행동이 관찰되지 않으면 유충은 무반응입니다. 응답자는 2가지 범주로 더 나눌 수 있습니다. 금단 행동이 5초 이내에 보이면 유충이 빠르게 반응하는 것입니다. 금단 행동이 5-20초 사이에 보이면 유충은 느리게 반응하는 것입니다(그림 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

결과

그림 1: 국소 열 프로브 분석을 위한 실험 설정. 열 프로브는 프로브의 온도를 설정하고 유지하는 데 사용되는 열 제어 장치에 의해 제어됩니다. 프로브는 전후 축에 수직으로 유지되며 수평으로 45° 각도로 유충을 자극하는 데 사용됩니다. 프로브 접촉은 그림과 같이 복부 분절 A4에서 특이적으로 이루어집니다. 사용자는 20초 컷오프까지 또는 롤링 동작이 시작될 때까지 부드러운 압력으로 이 접촉을 유지해야 합니다. 온도가 유해한 것으로 인식되면 유충은 적어도 한 번의 360° 굴림을 특징으로 하는 혐오스러운 금단 행동을 보일 것입니다. 롤의 수는 단일 또는 다수일 수 있습니다(그림 2B 참조).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
열 프로브	Pro-Dev 엔지니어링	주문형 맞춤형 구축	요청 시 연락처 정보를 제공할 수 있습니다.
라이카 DFC290 12V/400mA 컬러 카메라	라이카 마이크로시스템즈	12730080	동등한 카메라라면 무엇이든 할 수 있습니다.
Leica MZ6 현미경	라이카 마이크로시스템즈	MZ6 줌 본체(광학 캐리어)의 부품 번호는 10445614입니다.
Schott Ace 모듈amp 유닛	쇼트 AG	A20500
Schott 듀얼 구즈넥 23인치 광섬유 라이트 가이드	쇼트 AG	쇼트 A08575
열 제어 장치	(주)티에스씨	맞춤형 제작	자세한 내용은 요청 시 제공될 수 있습니다.
Zeiss Stemi 2000 현미경	칼 자이스, Inc.	NT55-605	동등한 현미경이라면 무엇이든 할 수 있습니다.
집게	정밀 과학 도구	FS-1670
화필	Blick 미술 재료	제06762-1002
35 x 10mm 폴리스티렌 페트리 접시	팔콘 BD	351008	우리는 대체 요리를 테스트하지 않았습니다.
비닐 조각	오피스 디포	480009

호