온도 구배 분석: 초파리 유충의 온도 선호도를 테스트하는 방법

초록

출처: Liu, J., et al. 초파리 유충의 열 선호도를 결정하기 위한 온도 구배 분석. J. Vis. 특급 (2018).

초파리 초파리는 작은 온도 변화를 구별할 수 있으므로 열 조건이 유리한 환경을 선택할 수 있습니다. 이 비디오는 선형 열 구배에서 초파리 유충의 온도 선호도를 테스트하는 행동 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Liu et al.에서 발췌한 것입니다. 초파리 유충의 열 선호도를 결정하기 위한 온도 구배 분석, J. Vis. Exp. (2018).

1. 온도 구배 설정

1. 단방향 그라디언트 준비
   1. 분석 중 습한 주변 환경을 만들려면 두 개의 수조에 연결된 두 개의 알루미늄 블록을 젖은 종이 타월 위에 10cm 간격으로 놓습니다(그림 1A).
   2. 분석을 시작하기 ~2시간 전에 두 개의 수조를 켜서 알루미늄 블록의 온도가 평형을 이룰 수 있도록 충분한 시간을 허용합니다.
      참고: 원하는 선형 온도 구배를 달성하는 데 필요한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하기 위한 몇 가지 일반적인 온도 쌍이 표 1에 나열되어 있습니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 튜브에서 냉각이 있기 때문에 온도에도 영향을 미칩니다. 우리 설정에서 튜브의 길이는 1.5m입니다.
   3. 500mL의 둥근 입구 병에 1% 아가로스 100mL를 고출력 설정으로 전자레인지에 넣고 평평한 벤치탑에 25mL/분석 플레이트를 붓습니다. 알루미늄 블록에 동시에 배치할 수 있는 두 개의 분석 플레이트를 준비합니다(그림 1A).
   4. 아가로스가 응고된 후(10-20분) 표준 주방 스폰지 또는 멜라민 스펀지로 각 아가로스 표면을 부드럽게 문질러 아가로스 표면을 약간 거칠게 만들어 아가로스 젤에 물을 분사할 때 매끄럽고 얇은 물막이 생성되고 물방울이 형성되지 않도록 합니다.
   5. 플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해 분석을 수행할 준비가 될 때까지 증류수가 담긴 용기에 플레이트를 완전히 담그십시오.
2. 양방향 그래디언트 준비(선택 사항)
   1. 분석 중 습한 주변 환경을 조성하려면 젖은 종이 타월 위에 8cm 간격의 알루미늄 블록 3개(그림 1B)를 놓습니다.
   2. 분석을 시작하기 ~2시간 전에 두 개의 수조를 켜서 알루미늄 블록의 온도가 평형을 이룰 수 있도록 충분한 시간을 허용합니다.
      참고: 양방향 구배에 대한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하기 위한 몇 가지 일반적인 온도 쌍은 표 2에 나열되어 있습니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 튜브에서 냉각이 있기 때문에 온도에도 영향을 미칩니다. 우리 설정에서 튜브의 길이는 1.5m입니다.
   3. 아가로스가 플레이트에서 쏟아지는 것을 방지하려면 알루미늄 플레이트의 가장자리를 라벨링 테이프로 감싸 10mm 높이의 벽을 형성합니다(그림 1B).
   4. 고출력 설정을 사용하여 500mL의 둥근 입구 병에 1% 아가로스 200mL를 전자레인지에 넣고 120mL를 분석 플레이트에 붓습니다.
   5. 아가로스가 굳은 후(~30분) 표준 주방 스펀지 또는 멜라민 스펀지로 각 아가로스 표면을 부드럽게 문질러 아가로스 표면을 약간 거칠게 만들어 아가로스 젤에 물을 분사할 때 매끄럽고 얇은 물막이 생성되고 물방울이 형성되지 않도록 합니다.
   6. 분석이 건조되는 것을 방지하기 위해 분석을 수행할 준비가 될 때까지 분석 플레이트를 증류수가 담긴 용기에 완전히 담그십시오.
3. 단방향 그라디언트 설정
   1. gradient assay apparatus 옆의 벤치에서 시약과 항목을 준비합니다(Table of Materials(재료표) 참조).
   2. 효율적인 온도 전달을 촉진하려면 블록과 플레이트 사이의 계면에 물을 분사하여 알루미늄 블록과 분석 플레이트 사이의 틈을 메우십시오.
   3. 장갑을 사용하여 물통에서 분석 플레이트를 제거합니다. 아가로스 겔과 플레이트 사이에 물이 침투하여 표면에 돌기가 생기면 P1000 마이크로피펫으로 물기를 제거합니다.
   4. 양쪽 가장자리에서 2cm의 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하도록 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 놓습니다(그림 1A,C).
   5. 플레이트 표면에 물을 분사하여(아가로스 표면을 덮고 있는 얇은 물막으로 충분함) 아가로스 겔이 마르는 것을 방지합니다. 유충이 물방울에 갇힐 수 있으므로 물막이 연속적이고 물방울이 없는지 확인하십시오.
   6. 그라디언트 시스템을 판지 상자로 덮어 수분 증발을 줄이고 겔 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 됩니다. 온도가 평형을 이룰 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
   7. 플레이트의 12개 지점에서 표면 온도를 확인합니다(그림 1C). 각 영역 내에서 두 가지 측정을 수행하여 영역 내에 변동성이 있는지 여부를 확인합니다. 두 지점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
      참고: 영역 내의 변동성은 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리까지 두 지점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 발생합니다. 알루미늄 블록에서 플레이트의 위치를 조정하여 양쪽 가장자리에서 2cm의 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는지 확인합니다.
   8. 측정된 온도 구배가 원하는 구배에서 벗어나면 수조 온도 설정을 높이거나 낮추고 수조의 온도가 안정된 후 표면 온도를 다시 확인하십시오.
   9. 분석을 시작할 때까지 그래디언트 시스템을 판지 상자로 덮습니다.
4. 양방향 그라디언트 설정(선택 사항)
   1. gradient assay apparatus 옆의 벤치에서 시약과 항목을 준비합니다(Table of Materials(재료표) 참조).
   2. 3개의 알루미늄 블록의 표면에 물을 분사하여 표면 사이의 틈을 채워 알루미늄 블록에서 분석 플레이트로의 효율적인 온도 전달을 촉진합니다.
   3. 물통에서 분석 플레이트를 조심스럽게 제거하고 알루미늄 블록 위에 놓습니다. 아가로스 겔과 플레이트 사이에 물이 침투하여 표면에 돌기가 생길 수 있는 경우 P1000 마이크로피펫으로 물을 제거합니다.
   4. 양쪽 가장자리에서 첫 번째 영역과 마지막 영역의 중간선이 두 측면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하도록 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 놓습니다(그림 1B,D).
   5. 플레이트 표면에 물을 분사하여(아가로스 표면을 덮고 있는 얇은 물막으로 충분함) 아가로스 겔이 마르는 것을 방지합니다. 유충이 물방울에 갇힐 수 있으므로 물막이 연속적이고 물방울이 없는지 확인하십시오.
   6. 그라디언트 시스템을 판지 상자로 덮어 수분 증발을 줄이고 겔 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 됩니다. 온도가 평형을 이룰 때까지 5-10분 정도 기다립니다.
   7. 10개 구역 각각의 정중선을 따라 2개 지점에서 표면 온도를 확인합니다(그림 1D). 각 영역 내에서 두 가지 측정을 수행하여 영역 내에 변동성이 있는지 여부를 확인합니다. 두 지점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
      참고: 영역 내의 변동성은 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리까지 두 지점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 발생합니다. 알루미늄 블록에서 플레이트의 위치를 조정하여 각 가장자리에서 가장 가까운 첫 번째 및 마지막 영역의 정중선이 두 측면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는지 확인합니다.
   8. 측정된 온도 구배가 원하는 구배에서 벗어나면 수조 온도 설정을 조정하고 수조의 온도가 안정된 후 표면 온도를 다시 확인하십시오.
   9. 분석이 시작될 때까지 블록을 판지 상자로 덮습니다.

2. 분석 및 계산

1. 골판지 상자를 제거하고 유충을 플레이트로 옮기기 직전에 젤 표면 온도를 확인하십시오. 온도 평형을 방해하지 않도록 판지 상자가 열려 있는 시간을 최소화하십시오. 표면이 건조하면 표면에 소량의 물을 분사하십시오.
2. 150 ± 50 유충을 단방향 구배(방출 영역; 그림 1C).
   참고: 양방향 구배의 경우 각 절반의 중간 영역을 따라 200-400 개의 유충을 분포시킵니다 (그림 1D).
3. 유충이 기어 나오는 것을 방지하기 위해 각 분석 플레이트 위에 마이크로플레이트 뚜껑을 놓습니다. 아가로스 젤의 유충 선택에 영향을 줄 수 있는 빛 노출을 방지하기 위해 판지 상자로 설정을 덮습니다.
   참고: 양방향 구배의 경우, 플레이트가 더 크고 유충의 선호 온도가 중간 영역에 있기 때문에 플레이트를 뚜껑으로 덮을 필요가 없습니다. 결과적으로 가장자리에 축적되는 유충은 거의 없으며 기어 나올 기회가 있습니다.
4. 유충의 나이에 따라 단방향 구배의 경우 10-30분, 양방향 구배의 경우 15-35분 동안 분석이 진행되도록 합니다(표 3).
5. 판지 상자와 마이크로플레이트 뚜껑을 제거합니다. 디지털 카메라를 사용하여 위에서 접시를 촬영합니다. 조사자가 분석을 위해 대비와 밝기가 더 나은 플레이트를 선택할 수 있도록 각 분석 플레이트의 사진을 두 장의 사진으로 찍습니다.
6. 흡인에 의해 분석 플레이트와 플레이트 외부의 아무 곳에서나 모든 유충을 제거합니다.
7. 분석 플레이트, 튜브 및 세포 여과기를 증류수로 철저히 청소합니다. 아가로스의 표면이 손상되지 않는 한 그날 준비된 분석 플레이트를 재사용하십시오.
8. 각 구역에서 유충의 백분율 분포를 계산합니다.
   1. 이미지에 표시를 추가할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 분석 결과의 사진 이미지를 엽니다. 분석 영역을 표시하려면 분석 플레이트의 경계를 기준으로 2cm마다 수직선을 그립니다.
   2. 각 구역의 유충 수를 세고 숫자를 기록하십시오. 벽에서 0.5cm 떨어진 지역의 유충을 세지 마십시오. 겔은 벽 근처에서 더 두껍고 표면 온도는이 영역에서 선형이 아닙니다.
   3. 단방향 그래디언트의 경우 다음과 같이 각 영역의 백분율 분포를 계산합니다.
      (주어진 2cm 영역의 유충 수) / (6 개 영역의 총 유충 수) x 100.
   4. 양방향 그래디언트의 경우 다음과 같이 각 영역의 백분율 분포를 계산합니다.
      (주어진 2cm 구역의 유충 수) / (구배의 양쪽에있는 5 개 구역의 총 유충 수) x 100.

결과

그림 1: 단일 및 양방향 그래디언트 분석 설정. (A) 두 개의 알루미늄 블록에 두 개의 알루미늄 분석 플레이트가 있는 단방향 구배 설정. 알루미늄 블록의 온도는 두 개의 수조에서 물을 순환시켜 제어됩니다. (B) 양방향 구배를 위한 세 개의 알루미늄 블록, 수조 및 알루미늄 플레이트(250 x 220mm)의 배열. 왼쪽 및 오른쪽 블록은 동일한 수조에 연결되고 중간 블록은 다른 수조에 연결됩니다. 알루미늄 분석 플레이트는 테이프로 감겨 10% 아가로스를 포함하는 1mm 벽을 형성합니다. (C) 온도(점으로 표시)를 확인하고 접시에 유충을 방출하는 위치. 실험을 시작하기 전에 각 구역 내의 두 지점에서 온도를 확인하여 원하는 선형 온도 구배가 설정되었는지 확인하십시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
그래디언트 분석 장치
PolyScience 9106, 냉장/가열식 6L 순환 수조	토마스 사이언티픽	9106	이 모델은 단종되었습니다. 업데이트된 교체 모델에는 120V, 60Hz용 1186R00 및 1197U04 또는 240V, 50Hz용 1184L08 및 1197U04가 포함됩니다.
알루미늄 분석 플레이트(단방향 구배용)			외부 크기: 14 x 10.1 x 0.9cm, 내부 크기: 12.9 x 8.7 x 0.8cm, 검은색 아노다이징 처리.
알루미늄 플레이트(양방향 그라디언트용)			25 x 22 x 0.2cm, 블랙 아노다이징 처리.
알루미늄 블록			외부 크기: 25.5 x 5 x 1.4cm, 내부 채널의 매개변수는 그림 1D에 나와 있습니다.
알루미늄 블록 및 튜브용 커넥터	맥마스터-카	91355K82
Tygon 위생 실리콘 튜빙	타이곤	57296	1/4 ID x 3/8 OD x 1/16 벽
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
분석용 항목 및 시약
막자	미국 과학	17361	1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브용 유봉
온도계	요행수	51II
열전대	요행수	K형
범용 마이크로플레이트 뚜껑	코 닝	6980A77
35mm 접시	코 닝	9380D40
라벨링 테이프(양방향 그라디언트용)	피셔 사이언티픽	제15-951	Fisherbrand 라벨링 테이프 2인치 x 14야드
아가로스	인비트로젠	16500500	1% 용액 준비
자당	시그마	S0389-5KG	분석을 시작하기 직전에 18% 용액을 준비하십시오.
페인트 브러시	피셔 사이언티픽	11860
50 mL 원심분리기 튜브	덴빌	C1062-P
스쿠풀라	피셔 사이언티픽	14-357큐
500mL 둥근 입이 넓은 병	파이렉스	1395-500
셀 스트레이너(300mm 공극)	플루리셀렉트	Tel.: 43-50300	유충 세척을 위한 선택 품목
골판지 상자(바이알 트레이)	제네시 사이언티픽	FS32-124

년 년 시리즈 호 년 년