$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
이 프로토콜은 de Vries and Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Channelrhodopsin 파리 생성
- Cross UAS-ChR2는 선택한 Gal4 드라이버와 함께 비행하며, 시신경의 Foma-1 뉴런에서 발현되는 G105-Gal4를 사용합니다.
- 청색광 자극에 대한 시각적 반응 가능성을 없애기 위해, 두 플라이 라인은 모두 w+norpA 배경에 있습니다.
- 최종 결과: w+norpA; G105-갈4/UAS-ChR2 +
- 성충 파리가 가까이 다가간 후, 행동 분석을 수행하기 전에 3일 동안 10μM all-trans-retinal(ChR2에 필요한 보조 인자)을 보충하고 빛으로부터 보호한 신선한 음식을 선택된 암컷에게 먹입니다.
2. 10μM All-trans-retinal 강화 식품 만들기
- 100mg의 올 트랜스 레티날을 95% 에탄올 17.6ml에 용해시켜 20mM 망막을 만듭니다. 모든 경망막을 항상 빛으로부터 보호하십시오.
- 표준 옥수수 가루 플라이 푸드를 전자레인지에 녹이고 만졌을 때 따뜻해질 때까지 식히십시오.
- 50μl의 20mM all-trans-retinal을 10ml의 파리 음식 바이알에 혼합합니다.
- 바이알을 식히고 빛으로부터 보호하십시오.
3. 장비
- 피펫 팁: 표준 1,000 μl 피펫 팁은 팁 근처에서 절단되어 ~2.25 mm의 공극 직경을 생성합니다.
- 플랫폼(그림 1 참조).
- 17cm X 25cm의 Delrin 베이스는 1/4" NPT 냉각수 호스 커넥터에 맞도록 각 모서리에 나사 구멍이 있어 제작되었습니다.
- Delrin으로 만든 수직 홀더가 받침대 중앙에 부착됩니다. 전체 치수는 25mm X 40mm X 65mm(너비 X 깊이 X 높이)입니다. 10mm 너비의 홈이 홀더의 길이를 따라 흐르며 바닥에는 나비 나사가 있습니다. 플랫폼은 25mm X 40mm X 10mm의 홀더 상단에 부착되며 직경 3.5mm의 구멍이 홀더의 홈과 정렬됩니다.
- LED 어레이(그림 1).
- ~18cm 길이의 냉각수 호스 암 4개가 냉각수 호스 커넥터를 사용하여 플랫폼 베이스에 부착됩니다. 냉각수 호스는 구조적 지지대로만 사용되며 냉각 목적으로는 사용되지 않습니다.
- 각 암의 끝에 방열판을 부착하기 위해 각 암의 냉각수 호스의 마지막 부분에 적절한 간격의 홈을 절단합니다.
- 파란색 LED Rebel Tri-Stars는 미리 절단된 열 접착 테이프를 사용하여 각 방열판에 장착됩니다. Carclo 18° 트라이 렌즈가 각 트라이 스타에 부착되어 있습니다.
- LED Tri-Stars는 지정된 대로 BuckPuck DC 드라이버와 전원 공급 장치에 연결됩니다. 우리는 각 BuckPuck이 시리즈로 두 개의 Tri-Stars에 전원을 공급하도록 설정을 준비했습니다.
- 700mA에서 4개의 LED Tri-Star의 조명은 모두 플랫폼에서 713W/m2의 방사 조도를 산출했습니다.
- 카메라: 카메라는 작은 삼각대에 장착되고 플랫폼 상단에 초점이 맞춰집니다.
4. 행동 분석
- 얼음 위에서 파리를 잠시 마취합니다.
- 테이프를 사용하여 팁의 양쪽 끝을 닫아 피펫 팁에 개별 파리를 놓습니다.
- 파리가 깨어나 피펫 팁을 적극적으로 탐색한 후 테이프를 제거하고 수직 홀더의 홈에 피펫을 놓습니다. 나비 나사는 피펫 팁을 제자리에 고정하고 팁 바닥을 닫는 데 사용됩니다.
- 파리가 피펫 팁을 탐색하면서(일반적으로 30 - 60초) 파리가 피펫 끝에서 플랫폼으로 나오기 직전에 카메라 녹화를 시작합니다.
- 파리가 플랫폼에 나타난 후 1-2초 동안 기다렸다가 파란색 LED를 켭니다. 타이머를 사용하여 파리가 비행을 시작할 때까지의 시간을 수동으로 측정합니다.
