Preparation of Drosophila Heart: A Technique to Study Heart Physiology in the Adult Fly(초파리 심장의 준비: 성충 파리의 심장 생리학을 연구하는 기술)

초록

출처: Vogler, G., Ocorr, K. 초파리의 박동하는 심장 시각화. J. Vis. 특급 (2009).

이 비디오는 파리의 성인 심장 또는 초파리 등쪽 혈관이라고 불리는 것을 설명합니다. 주요 프로토콜은 살아있는 심장 준비를 위한 해부 절차를 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Vogler and Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009)에서 발췌한 것입니다.

1. 시작하기 전에

1. 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM 자당, 5mM 트레할로스, 5mM HEPES(pH 7.1, Sigma Chemicals의 모든 시약)를 함유하는 인공 혈림프(AH) 용액을 신선하게 준비합니다. 자당과 트레할로스는 박테리아 오염을 방지하기 위해 사용 직전에 냉장 원액에서 AH에 첨가해야 합니다.
2. AH를 실온으로 가져오고 최소 15분 동안 공기 버블링으로 용액에 산소를 공급합니다.
3. 지방 제거에 필요한 여러 개의 미세한 모세관(예: 유리 모세관, 100ul, VWR)을 당깁니다.

2. 성인 파리의 반온전한 초파리 심장

1. 성충 초파리는 Fly Nap(Carolina Biological Supply Co.)으로 2-5분 동안 마취합니다. 더 긴 노출을 위해 Fly Nap에 파리를 남겨두지 않도록 주의해야 합니다. 추위에 단기간 노출되는 것도 파리를 마취하는 데 사용할 수 있지만 CO₂는 심박수와 리듬에 더 오래 지속되는 영향을 미치므로 권장하지 않습니다.
2. 마취된 파리를 등쪽이 아래를 향하게 하여 얇은 바셀린 층으로 코팅된 페트리 접시에 넣습니다. 날개와 몸통의 소수성 표피는 젤리에 역방향으로 "달라붙지만" 필요한 경우 파리의 위치를 변경할 수 있습니다. 이는 후속 조작 중에 특히 중요합니다.
3. 초기 절단은 구부러진 스프링 가위(Roboz #5611)를 사용하여 이루어집니다. 가위날은 다리 아래에 배치되고 목 근처 흉부의 등쪽 표면을 향해 각도를 맞춥니다. 머리, 복부 신경삭 및 다리는 한 번의 절단으로 제거됩니다. 그런 다음 제제를 산소가 공급된 인공 혈림프(AH) 용액에 담급니다.
4. 스프링 가위를 사용하여 복부의 뒤쪽 끝(복부 분절 7과 8로 구성됨)을 한 번의 절단으로 제거합니다. 이것은 복부의 양쪽 가장자리를 따라 측면 절단을 할 수 있는 접근성을 제공하고 후방 장과 복부 표피 사이의 연결을 절단하는 역할을 합니다. 그런 다음 복부 복부 표피의 해방된 피판을 제거합니다.
5. 3단계와 4단계에서는 장의 전방과 후방 연결이 절단되어 복부 장기가 기관에 의해서만 제자리에 고정됩니다. 장 및 기타 복부 장기는 일반적으로 보석상의 집게(Roboz, #55)와 부드러운 잡아당기기를 사용하여 단일 덩어리로 제거할 수 있습니다. 내부 장기를 제거하면 지방체로 둘러싸인 등쪽 표피에 여전히 붙어 있는 박동하는 심장관이 드러납니다.
6. 지방체는 광학 현미경에서 매우 불투명하기 때문에 심장관을 명확하게 보기 위해 이 지방의 일부를 제거해야 하는 경우가 많습니다. 이는 미세하게 그려진 유리 모세관을 사용하는 지방 흡입 기술에 의해 수행됩니다. 모세 혈관은 표준 피펫 풀러(예: Sutter P-97 피펫 풀러)를 사용하여 만든 다음 진공 소스에 부착된 플라스틱 튜브(Tygon, 1/16")에 삽입합니다. 이 시스템은 심장관 주변의 과도한 지방을 흡입하는 데 사용됩니다. 흡입력은 팁 직경에 비례하므로 팁이 직경이 40미크론보다 큰 피펫을 사용해서는 안 됩니다. 심장 자체를 만지지 않도록 각별한 주의를 기울여야 하며, 심장의 뒤쪽 부분은 매우 연약하기 때문에 해당 부위를 완전히 피해야 합니다.
7. 성인 초파리 심장관이 이제 노출되어 박동해야 합니다. 필요한 경우, 바셀린에서 큐티클을 부드럽게 들어 올린 다음 조심스럽게 다시 밟아 심장 조직과의 접촉을 피함으로써 큐티클과 부착된 심장의 위치를 변경할 수 있습니다. 이 시점에서 제제를 목욕시키는 용액은 새 AHL로 교체해야 합니다. 이 제제는 조작하기 전에 산소화로 20-30분 동안 평형을 이루어야 합니다. 제제를 60분 이상 유지해야 하는 경우 신선한 AHL을 관류해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로 해부 스프링 가위(곡선형)	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5611	총 삭감에 적합 (2단계)
마이크로 해부 스프링 가위 (스트레이트)	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5620
Dumont #55 겸자	정밀 과학 도구	11295-51
Dumont #5 겸자	정밀 과학 도구	11295-10
유리 모세관, 미세	과학 제품	GB100T8P
피펫 풀러	셔터 장비	P-97	수평 및 수직 피펫 풀러가 모두 작동합니다.
플라스틱 튜브	타이곤	1/16" 내경	100 μL 모세관용
히스토아크릴릴® 티슈 접착제	B. 브라운 메디컬

년 년