C. 예쁜꼬마선충 배반구 해부: 난자 껍질을 제거하고 배아 세포를 해리하는 방법

초록

출처: Hsu, C. R., et al. 고립된 Caenorhabditis elegans 배아 할구 및 접착성 폴리스티렌 비드를 사용한 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성.J. Vis. 특급(2019).

이 비디오는 초기 배아에서 C. elegans 할구를 분리하는 방법을 소개합니다. 그 결과로 생성된 세포는 세포 배양 또는 생체 외 실험에 적합합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Hsu et al, In Vitro Recomposition of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp.(2019).

1. 배아 배반구의 분리
2. 장갑과 실험실 가운을 착용하여 표백 용액에 베이거나 접촉하지 않도록 하십시오.
   1. 오른손과 왼손으로 미세모세관(용량, 10μL)의 양쪽 끝을 잡습니다.
   2. 미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 장력을 가하고 모세관의 중심을 버너 위로 가져와 두 개의 손으로 당긴 모세관을 만듭니다(그림 1A).
   3. 해부 현미경 아래에서 손으로 당긴 모세혈관의 끝을 집게로 자르고 당겨진 모세관을 구강 피펫팅 장치에 부착합니다. 두 가지 유형의 피펫을 준비합니다. 피펫의 팁 개구부 크기는 배아 이식 및 난자 껍질 제거를 위한 C. elegans 배아(30μm)의 단축 길이(그림 1B-D)의 약 2배 및 1배여야 합니다.
   4. 45μL의 달걀 염 용액을 멀티웰 슬라이드의 웰에 피펫팅합니다(그림 2A, 하단).
   5. 5-10마리의 성체 예쁜꼬마선충을 달걀 소금 용액이 들어 있는 우물에 넣습니다.
   6. 초기 예쁜꼬마선충 배아를 얻으려면 예쁜꼬마선충 몸통의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 놓고 바늘을 서로 지나쳐 밀어 성체를 조각으로 자릅니다(그림 2A, 위 도식).
   7. 45μL의 차아염소산염 용액을 계란 염 용액이 들어 있는 웰 옆의 웰에 피펫팅합니다(그림 2B).
   8. 차아염소산염 용액이 포함된 웰 옆에 있는 후속 3개의 웰에 Shelton의 성장 배지 45μL를 피펫팅합니다(그림 2B).
   9. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입으로 피펫팅하여 1 세포 단계 및 초기 2 세포 단계 배아를 차아염소산염 용액으로 이식합니다(그림 2B).
   10. 40-55초 동안 기다립니다.
   11. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입으로 피펫팅하여 차아염소산염 용액의 배아를 Shelton의 성장 배지로 배아를 이식하여 배아를 세척합니다(그림 2B).
   12. 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입으로 피펫팅하여 배아를 Shelton의 성장 배지의 새로운 웰로 옮겨 배아를 다시 씻습니다(그림 2B).
   13. 세척된 배아를 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입으로 피펫팅하여 Shelton의 성장 배지의 새로운 웰로 옮깁니다. 달걀 껍질을 제거하기 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 피펫팅을 조심스럽게 반복합니다(그림 2C, 중간 회로도). 난각이 성공적으로 제거되면 배아 세포는 더 구형이 됩니다(그림 2C, 오른쪽).
   14. 난자 껍질을 제거하기 위해 손으로 그린 모세관으로 부드럽고 지속적으로 피펫팅하여 2세포 단계 배아 할구를 분리합니다(그림 2D).

그림 1: 배구체 분리.(A) 유리 모세관을 손으로 당기는 것. (B) 배아 이식을 위한 손으로 그린 유리 모세관. (C) 달걀 껍질 제거를 위한 손으로 그린 유리 모세관. (D) 달걀 껍질 제거를 위한 모세관 개구부의 적절한 크기를 보여주는 설계도. 화살표는 배아를 나타냅니다. 눈금 막대는 100μm를 표시합니다.

그림 2: 배반구 분리 워크플로우.(A) 배아를 얻기 위해 난염 완충액에서 성체 C. elegans를 해부합니다. 사진은 난자 껍질을 제거하기 전의 2세포 및 4세포 단계 배아를 보여줍니다. (B) 차아염소산염 처리 및 세척. (C) 설계도는 달걀 껍질 제거를 위한 적절한 시기를 나타냅니다. 사진은 난자 껍질 제거 후의 4세포 단계 배아를 보여줍니다. (D) 배반구 분리. 사진은 분리된 2세포 단계 배아를 보여줍니다. C와 D의 화살표 크기는 파이펫팅 중에 필요한 상대적인 힘을 나타냅니다. 눈금 막대는 50μm를 표시합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
흡인기 튜브 어셈블리	드러먼드	포반구 분리를 위해.
Caenorhabditis elegans 균주 : N2, 야생형	Caenorhabditis Genetics Center	엔2	이 연구에 사용된 균주
Caenorhabditis elegans 균주 : KSG5, 유전자형 : zuIs45; itIs37	사내에서	KSG5	이 연구에 사용된 균주
보정된 Mircopipets, 10 μL	드러먼드	21-180-13	포반구 분리를 위해
CD 지질 농축액	생명 기술	11905031	포반구 분리를 위해. 조직 배양 후드에서 작업합니다.
클로록스	클로록스	해당 없음	포반구 분리를 위해. 차아염소산염 처리가 잘 작동하지 않을 때 새 병을 엽니다.
커버슬립 홀더	사내에서	해당 없음	포반구 분리를 위해.
해부 현미경: M 스탠드가 있는 Zeiss Stemi 508. 광원은 내장 LED입니다. 접안 렌즈의 배율은 10X입니다.	칼 자이스	스테미 508	포반구 분리를 위해.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, 캐나다 원산지	지브코	A3160701	포반구 분리를 위해. 조직 배양 후드에서 작업합니다.
범용 및 정밀 글라이드 피하 주사 바늘, 25 게이지	BD (영어)	14-826AA	포반구 분리를 위해
이눌린	알파 에자르	AAA1842509	포반구 분리를 위해
MEM 비타민 용액 (100개)	지브코	11120052	포반구 분리를 위해.
Multitest Slide 10 웰	MP 바이오메디컬	ICN6041805	포반구 분리를 위해
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	지브코	15140148	포반구 분리를 위해.
폴리비닐피롤리돈	Fisher BioReagents	BP431-100	포반구 분리를 위해
염화칼륨	바이오샵	POC888	포반구 분리를 위해
Schneider's Drosophila 멸균 배지	지브코	21720024	포반구 분리를 위해. 조직 배양 후드에서 작업합니다.
염화나트륨	바이오샵	SOD001	포반구 분리를 위해
수산화나트륨 용액, 10N	피셔 케미컬	SS255-1 (영어	포반구 분리를 위해
주사기 필터, PTFE, 비멸균	바식스	13100115	포반구 분리를 위해.
Tygon S3 실험실 튜빙, 제형 E-3603, 내경 3.175 mm	Saint Gobain 성능 플라스틱	89403-862	포반구 분리를 위해.
Tygon S3 실험실 튜빙, 제형 E-3603, 내경 6.35mm	Saint Gobain 성능 플라스틱	89403-854	포반구 분리를 위해.

< >21-180-13호 시리즈 )