C. 예쁜꼬마선충 Chemotaxis Assay: 웜에서 Chemosensation을 테스트하는 방법

초록

출처: Campbell, J. C., et al. a Caenorhabditis elegans 영양 상태 기반 구리 혐오 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 선충 C. elegans의 화학주성을 소개하고 황산구리에 대한 화학주성 혐오를 테스트하는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌

한 것입니다.

1. 실험 유기체의 준비
   1. 분석을 시작하기 24시간 전에 균주당 10개의 L4 병기 선충을 선택하여 테스트 시 유기체가 어린 성인인지 확인합니다. 테스트된 각 돌연변이 또는 대조군 선충에 대해 10개의 L4(대조군의 경우 10개, 분석의 경우 10개)를 선택합니다.
      1. OP50 Escherichia coli가 파종된 표준 한천 플레이트에서 24시간 동안 표준 방법을 사용하여 L4 유기체를 유지합니다. 후속 세척 단계에서 유기체가 손실되면 시작 샘플 크기를 늘려 보상합니다(즉, 10개가 아닌 20개의 벌레 선택).
         참고: 행동은 선천적으로 가변적인 표현형입니다. 각 균주에 대해 3일에 걸쳐 3회씩 이 방법을 수행합니다. 토론 섹션에서 강조된 대로 새로운 균주에 대한 추가 제어 변형률 및 조건을 포함합니다.
   2. 분석 직전에 실험 유기체를 박테리아가 없는 한천 플레이트로 옮기고 선충이 1분 동안 자유롭게 움직여 과도한 박테리아를 제거하도록 합니다.
      1. 실험 유기체가 분석 전 24시간 동안 오염 조건을 경험한 경우 폐기하십시오.
   3. M9 1mL를 박테리아가 없는 플레이트에 피펫팅하여 마이크로 원심분리기 튜브로 벌레를 씻어냅니다.
   4. 3,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 벌레는 튜브 바닥에 펠릿을 형성해야 합니다. 웜 펠릿을 방해하지 않고 M9 용액을 흡입합니다. 웜 펠릿에 M9 1mL를 추가하고 튜브를 뒤집어 웜과 용액을 혼합합니다.
   5. 1.4단계를 세 번 더 반복합니다.
      1. 과도한 박테리아가 처음에 기생충과 함께 전염된 경우 총 5회 반복합니다. 어떤 박테리아도 구리 식품 레이스 플레이트로 옮겨져서는 안 됩니다. 식품이 분석 플레이트로 옮겨지면 정확한 데이터 수집에 방해가 됩니다.
   6. 최종 세척 후 M9가 100μL이고 웜 펠릿이 남을 때까지 상층액을 흡입합니다.
      주의: 굶주림과 관련된 행동은 30분 후에 분명해집니다. 따라서 웜은 세척 단계가 완료되면 용액에서 즉시 옮겨야 합니다.
2. 분석 플레이트의 준비
   1. 분석 2일 전에 표준 NGM 한천 플레이트를 준비합니다.
      1. 플레이트를 습한 환경에 보관하는 경우 분석 3일 전에 한천 플레이트를 만드십시오. 또는 적절한 건조를 위해 3 - 6시간 동안 플레이트의 뚜껑을 제거합니다(멸균 환경인 경우).
   2. 두꺼운 영구 마커를 사용하여 바깥쪽 가장자리를 따라 플레이트 아래쪽에 선을 긋고 다른 선을 만들어 중간선 장벽을 형성합니다(그림 1). 중간선 장벽은 플레이트의 각 가장자리에서 등거리에 있어야 합니다. 정확한 측정을 위해 눈금자를 사용하십시오. 이 선은 박테리아와 구리 용액을 옮길 때 가이드 역할을 합니다. E. coli가 구리 용액보다 먼저 전달되는 경우, 이 선은 지표 역할을 합니다.
   3. 균일한 잔디를 만들기 위해 구리 장벽의 한쪽 면에만 50μL의 OP50 E. coli가 있는 종자 플레이트(그림 2). 박테리아 농도는 분석 전반에 걸쳐 일관되게 유지되어야 합니다. 그러나 농도의 경미한 차이에 대한 반응으로 거의 변동성이 관찰되지 않았습니다.
      1. 플레이트 아래쪽에 표시된 선을 사용하여 박테리아가 구리 용액과 접촉하지 않도록 합니다. 구리 용액이 접시의 가장자리를 따라 정렬되고 중간 선 장벽을 형성하는 경우 구리 용액이 식품 공급원과 접촉하지 않도록 박테리아를 옮깁니다.
   4. 두 번째 플레이트 세트를 표시하고 OP50 E. coli를 옮기지 않습니다(그림 2). 이 플레이트는 네거티브 컨트롤을 평가하는 데 사용됩니다. 이 플레이트는 또한 초기 이송 원점을 나타내기 위해 플레이트의 절반에 표시가 있어야 합니다.
   5. 박테리아를 건조시킨 다음 37°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 37°C 인큐베이터 또는 실내로 옮길 때 박테리아 패치가 방해받지 않도록 하십시오. 과도한 방해는 음식 패치의 위치나 모양을 변경할 수 있습니다.
3. Chemotaxis 분석
   1. 분석 시작 시간 전에 0.5M 황산구리(II) 용액을 새로 준비합니다. 플레이트당 125μL의 용액을 사용하는 경우, 사용된 분석 플레이트의 수에 따라 이 부피를 확장할 수 있습니다(예: 5개의 분석 플레이트, 625μL).
   2. 한천 가장자리에 황산구리(II) 용액 100μL를 피펫팅하여 외부 구리 장벽을 만듭니다. 표시된 접시 밑면은 가이드 역할을 해야 합니다.
   3. 25 μL의 황산구리(II) 용액을 피펫팅하여 정중선 장벽을 생성합니다.
      1. 구리(II) 황산염 용액이 박테리아 패치와 접촉하지 않도록 하십시오. 줄무늬가 한천의 움푹 들어간 곳/긁힘으로 인해 운동에 영향을 줄 수 있으므로 점박이 기술을 사용하십시오.
   4. 구리 용액을 플레이트에서 건조시킵니다. 기간은 플레이트 및 실험실 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 이송 후 5분마다 건조도를 육안으로 확인하십시오.
      참고: 구리 용액은 푸른 색조를 나타내며 쉽게 식별할 수 있습니다. 실험실 티슈를 사용하여 접시 가장자리 근처의 용액을 가볍게 두드려 건조를 식별합니다.
   5. 튜브 바닥에서 웜 펠릿 20μL를 분석 플레이트의 박테리아가 없는 절반으로 피펫팅합니다.
      1. 10개의 웜이 분석 플레이트로 옮겨졌는지 확인합니다. 실수로 여분의 벌레가 포함된 경우 할로겐화 오일로 골라서 제거하여 플레이트에 박테리아가 추가되지 않도록 합니다. 각 분석은 분석 중에 일관된 수의 선충을 가져야 합니다.
         참고: 분석 중에 옮겨지는 벌레가 너무 적은 경우 초기 샘플 크기를 늘리면 세척 및 옮기기 중 잠재적인 손실을 줄일 수 있습니다.
   6. 실험실 티슈로 플레이트에서 여분의 M9를 제거합니다. M9는 황산구리(II) 용액과 접촉해서는 안 됩니다.
      주의: 이 단계를 수행하는 동안 웜과 한천 표면이 영향을 받지 않는지 확인하십시오. 너무 가혹하게 사용하면 실험실 조직이 플레이트의 한천 표면에 움푹 들어간 곳을 만들고 벌레를 제거할 수 있습니다. KimWipe를 통해 실수로 제거된 웜은 폐기해야 합니다.
   7. M9 용액이 제거되고 모든 웜이 비액체 운동 패턴을 시작하면, 분석 스톱워치를 시작합니다.
      1. 가장 좋게는 1분 이내에 M9 솔루션을 제거하는 것입니다. 필수 매개변수는 정현파 운동의 식별입니다. 벌레는 액체에 있을 때 정현파보다는 몸부림과 같이 다르게 움직입니다. 분석을 시작하고 각 실험 유기체가 스래싱을 멈추면 스톱워치를 시작합니다.
   8. 30분마다 분석 플레이트를 확인하십시오.
      1. 박테리아 패치가 있는 분석 플레이트의 경우, 유기체가 4시간 동안 먹이 패치에 도달하면 긍정적인 점수를 매깁니다. negative control plates의 경우, 유기체가 장벽을 넘은 경우 긍정적인 점수를 매깁니다.

결과

그림 1: 5cm 페트리 접시 아래쪽에 구리 용액이 배치되어 있음을 나타내는 표시의 시각적 표현. 이러한 표시는 플레이트의 섹션이 적절하게 측정되었는지 확인하고 박테리아 패치와 구리 용액을 한천 표면으로 옮길 때 지침 역할을 하는 데 사용됩니다.

그림 2: 5cm 페트리 접시는 온/오프 식품 분석 플레이트를 위해 두 부분으로 나뉘며 박테리아 잔디는 온 푸드 플레이트를 위해 이러한 섹션 중 하나의 중앙에 형성됩니다. 식품 패치는 접시의 가장자리를 감싸고 정중선 장벽을 형성하는 ...

재료

<표 테두리="0" cellpadding="0" cellspacing="0" 스타일="너비:929px;" 너비="929"> 이 논문에 사용된 재료 목록 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 M9 솔루션 [3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1ml 1M MgSO4, H2O to 1리터. 사용하기 전에 살균하기 위한 오토클레이브.] 실험실에서 제작 황산구리 시그마 C-1297년 물을 사용하여 0.5M 농도로 적절하게 매달아 두십시오.