칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

초록

출처: Turek, M. et al. Caenorhabditis elegans의 장기 칼슘 이미징을 위한 아가로스 마이크로챔버.J. Vis. 특급(2015).

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. 칼슘 이미징

1. HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)])과 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 센서를 발현하는 형질전환 균주를 사용합니다.
2. 광시야 에피형광(wide-field epifluorescence)을 위해 장착된 복합 현미경을 사용하십시오. EMCCD 카메라의 TTL 출력을 LED의 TTL 입력에 연결하면 카메라가 프레임을 녹화할 때마다 샘플이 조명됩니다. 약 5msec의 노출 시간을 사용하십시오. 50 - 300 범위에서 EM 게인을 사용합니다.
3. 각 웜이 15 - 30분마다 이미징되는 24시간 동안 버스트 무비를 지정하고, 먼저 DIC로 20초 동안 이미징한 다음 GFP 형광으로 20초 동안 GCaMP를 기록한 다음 mKate2 신호의 최종 이미지를 촬영하여 발현 수준을 제어합니다. 각 버스트 동안 2/초의 프레임 속도를 사용합니다.
4. 시각적 데이터 검사의 경우 가색 맵을 사용하여 형광 강도의 작은 변화에 대한 가시성을 향상시킵니다. 형광 데이터를 ΔF/F로 플롯하고, F는 형광의 평균 기준선 값입니다. 칼슘 데이터 분석에 대한 자세한 설명은 문헌에서 확인할 수 있습니다.

재료