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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
이 프로토콜은 Teoh et al, Quantitative Approaches for Study Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)에서 발췌했습니다.
1. 체벽 근육 구조 정량화
- 체벽 근육 구조의 형광 이미징
- 미오신 섬유를 GFP.
로 표지하는 전이유전자 stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))을 운반하는 균주(예: RW1596)를 얻습니다.
참고: 동물에 전이유전자를 도입하는 것은 이미 전이유전자를 발현하는 동물과 관심 균주를 교배하거나 생식선의 원위팔에 DNA를 미세주입함으로써 달성할 수 있습니다. 이 전이유전자에서 rol-6 돌연변이에 의해 유도된 '롤링(rolling)' 표현형은 근육의 시각화를 용이하게 합니다. 체벽 근육은 등쪽과 배쪽을 따라 뻗어 있는데, 일반적으로 야생형 동물에서는 일반적으로 측면 중 하나에 있기 때문에 일반적으로 볼 수 없습니다. rol-6(su1006) 대립유전자는 동물의 뒤틀림을 유도하여 일부 근육 세포를 이미징에 노출시킵니다.
- 고해상도 CCD(Charged Coupled Device Camera), 40X 대물렌즈 이상, GFP 필터 및 획득 소프트웨어와 결합된 형광 현미경을 사용하여 동물을 이미지화합니다.
- 과포화된 이미지를 방지하기 위해 노출 시간과 조명 강도를 조정합니다.
- 적어도 하나의 완전한 가시적 사선 근육 세포를 포함하는 동물의 한 부분에서 근육 이미지를 캡처하고 저장합니다(400X 배율). 불완전한 단일 근육 세포가 있는 영역이나 초점이 맞지 않는 부분을 피하십시오. 또한 극단적인 전방 및 후방 영역과 외음부에 인접한 영역의 이미지를 제외합니다.
참고: 동물에게 눈에 보이는 완전한 근육 세포가 하나도 없는 경우 커버슬립을 부드럽게 밀어 동물을 뒤집어 완전한 세포가 드러나도록 합니다.
- 근육 세포 면적 측정
- 피지 소프트웨어에서 이미지를 엽니다(이 연구에서는 버전 2.0.0이 사용됨).
- 다각형 선택을 사용하여 단일 비스듬한 근육 세포 주위를 신중하게 추적할 수 있습니다. 앵커 점을 드래그하여 끝에 있는 다각형의 선을 조정하여 추적을 개선합니다.
- 소프트웨어 상단의 분석 탭으로 이동하고 측정을 클릭하여 선택 영역을 계산합니다. 면적 및 기타 측정값을 포함하는 별도의 결과 테이블이 표시됩니다. 결과 테이블에서 면적 측정이 누락된 경우 Analyze(분석) 탭 아래의 Set Measurements(측정 설정)로 이동하여 area box(면적 상자)가 선택되어 있는지 확인합니다. 마찬가지로 필요하지 않은 다른 측정값도 선택 해제합니다.
- 퇴화/누락된 영역이 있는 근육 세포의 경우 다각형 선택 도구를 사용하여 누락된 영역을 추적하고 측정을 다시 클릭합니다. 셀 내에 여러 개의 간격이 있는 경우 각 간격을 개별적으로 추적합니다.
- 전체 단일 근육 세포에 대한 틈 면적의 비율을 계산합니다. 비율이 높으면 세포 내의 큰 틈으로 인한 근육 퇴화 정도가 더 높다는 것을 나타냅니다. 야생형 동물에서 흔히 볼 수 있는 누락된 영역이 없는 경우 비율은 0.
로 계산됩니다.
참고: 대조군으로, 근육 구조 결함에 대해서도 시각적으로 점수를 매기고 결과를 정량적 측정과 비교합니다. 이는 실험실에서 처음으로 균주를 연구하는 경우에 특히 유용합니다. 표현형 채점을 위해 필라멘트의 무결성에 따라 동물을 결함이 있거나 없는 것으로 평가합니다. 예를 들어, 뚜렷한 필라멘트 줄무늬의 손실, GFP 응집 또는 구조적 파괴로 인한 근육 세포 내 틈이 있는 동물은 결함으로 점수가 매겨집니다.