표피 레이저 상처: 예쁜꼬마선충의 복구 과정을 조사하기 위한 국소 손상 유도

초록

출처: Xu, S. 및 Chisholm, A. D. 예쁜꼬마선충의 피부 상처 및 상처 반응 분석법.J. Vis. 특급(2014).

이 비디오는 벌레 표피에 매우 정밀한 부상을 입히는 데 사용되는 레이저 상처 방법을 소개합니다. 샘플 프로토콜은 상처 반응 및 복구에 대한 연구에서 가져온 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Xu and Chisholm, C. elegans, J. Vis. Exp. (2014)의 피부 상처 및 상처 반응 분석 방법.

1. 레이저 부상

참고: 펨토초 레이저 조사(800nm)를 사용하여 보다 정확한 상처를 입힙니다.

1. 녹인 2% 한천으로 유리 슬라이드에 한천 패드를 준비합니다. 패드가 예쁜꼬마선충의 실시간 이미징에 사용되는 한천 패드와 유사한지 확인하십시오.
2. 10마리의 어린 성충을 웜 픽으로 아가로스 패드에 옮기고 12mM 레바미솔 용액 2μl를 떨어뜨립니다. 커버 슬립으로 동물과 액체를 덮으십시오. 벌레가 마비될 때까지 1-2분 정도 기다립니다.
3. 유리 슬라이드를 회전 디스크 컨포칼 현미경에 놓습니다. 스테이지를 이동하여 기생충을 찾고 100X 대물렌즈(NA 1.4-1.46)로 측면 전방 또는 후방 세포융합 표피에 초점을 맞춥니다.
4. 펨토초 레이저의 출력을 140mW(대물렌즈 전에 측정)로 설정합니다. 펨토초 레이저를 80MHz의 반복률로 사용합니다.
   참고: 각각 200msec(20msec로 분리)의 두 펄스만으로도 손에 상처를 입기에 충분합니다.
5. 표피 세포의 정점 표면에 초점을 맞추고 표피에 상처를 입힙니다. 세포질의 국소 파괴(버블링) 또는 사용된 형광 마커의 국소 백화를 관찰합니다.
   참고: 펨토초 레이저를 사용할 때 적절한 레이저 안전 절차를 따르십시오. 두 개의 광자 현미경과 같은 펨토초 레이저를 사용하는 라인 또는 포인트 스캔은 레이저 상처에 충분한 전력을 제공해야 합니다.
   참고: 다른 레이저를 사용한 직접적인 경험은 없지만, 원칙적으로 기존 UV 레이저(예쁜꼬마선충 세포 절제술에 사용됨)를 사용하여 상처를 입힐 수 있어야 합니다. 선택적으로, 회전 디스크 컨포칼에 FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching) 모듈을 사용하여 표피를 감습니다(N. Pujol, 개인 통신).