FITC-덱스트란 공급: 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 정량화하는 방법

초록

출처: Le, T. A. N., et al. Caenorhabditis elegans의 장 투과성에 대한 박테리아 및 화학 물질의 영향 측정.J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 FITC 표지된 덱스트란을 지렁이에 공급하여 예쁜꼬마선충 장 내강의 무결성을 시각화하고 측정하는 방법을 소개합니다. 예시 프로토콜은 3,3'-디인돌릴메탄(DIM) 처리 및 병원균 사육 지렁이로 수행된 분석을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Le et al, a href="https://www.jove.com/video/60419/measuring-effects-bacteria-chemicals-on-intestinal-permeability"의 장 투과<성에 대한 박테리아 및 화학 물질의 영향 측정>Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

녹농균(P
1. . aeruginosa)을 공급한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 장 투과성에 대한 화학물질(DIM)의 영향을 테스트하기 위한 NGM 플레이트 준비
   1. 500mL 유리병(NGM 한천)에 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 자석 교반기, 한천 6.8g을 추가합니다.
   2. 다른 500mL 유리병(NGM 육수)에 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 한천이 없는 자석 교반기를 추가합니다.
   3. 두 개의 병(1.1–1.2단계부터), 빈 100mL 유리병 1개, 빈 500mL 유리병 1개를 121°C에서 15분 동안 고압멸균합니다. 그런 다음 병이 들어있는 매체를 수조에서 55 ° C로 30 분 동안 냉각시킵니다. 한천 배지를 수조에 보관하고 다음 단계를 위해 육수가 들어 있는 병을 제거합니다(1.2단계부터).
   4. NGM 국물에 첨가제 화학 물질을 첨가하십시오 : 1 M CaCl₂ 0.4 mL, 에탄올 (mL) 중 콜레스테롤 0.4 mL, 1 M MgSO₄ 0.4 mL 및 1 M KPO₄ 10 mL (이러한 모든 성분은 에탄올 내 콜레스테롤과 별도로 멸균해야 함). 그런 다음 55°C에서 자석 교반기로 혼합물을 철저히 저어줍니다.
   5. 오토클레이브 처리된 빈 500mL 유리병에는 디메틸설폭사이드(DMSO)를, 오토클레이브 처리된 빈 100mL 유리병에는 DIM을 표시합니다.
   6. NGM 육수 50mL를 DIM 라벨이 표시된 100mL 병에 옮깁니다. 20mM DIM 스톡 500μL를 병에 넣고 잘 섞습니다.
      참고: DIM은 DMSO(20mM DIM 스톡)에 용해됩니다.
   7. 수조에서 NGM 한천 배지를 빠르게 제거하고 NGM 한천 배지 50mL를 DIM 라벨이 표시된 병에 넣고 완전히 혼합합니다.
   8. 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DIM이 함유된 NGM 배지 20mL를 제공합니다. 이 단계에서 약 5개의 DIM을 함유하는 NGM 플레이트를 만들 수 있습니다.
      참고: 각 NGM 플레이트에서 DIM의 최종 농도는 100μM입니다.
   9. DMSO 함유 NGM 플레이트를 준비하려면 NGM 육수 150mL를 DMSO 라벨이 부착된 500mL 병에 옮깁니다. 병에 DMSO 1.5mL를 넣고 잘 섞습니다.
   10. NGM 한천 배지 150mL를 DMSO 라벨이 부착된 병에 넣고 완전히 혼합합니다.
   11. 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DMSO 함유 NGM 배지 20mL를 놓습니다. 이 단계에서 약 15개의 DMSO 함유 NGM 플레이트를 만들 수 있습니다.
       참고: 각 NGM 플레이트에서 DMSO의 최종 농도는 0.5%입니다.
   12. 플레이트를 실온에서 최소 3시간 동안 응고시키고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   13. 4°C 냉장고에서 E. coli OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 배양물을 제거하고 NGM 플레이트에 펴기 전에 배양물을 적절하게 와류로 가열합니다.
   14. 800μL의 E. coli OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 박테리아 배양을 각각의 새로운 NGM 한천 플레이트에 넣고 플레이트를 20°C 인큐베이터에서 밤새 건조시킵니다.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 세 번째 실험(그림 1)을 위해 살아있는 대장균 OP50으로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 2개, 살아있는 녹농균 PAO1로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 1개, 살아있는 녹농균 PAO1로 코팅된 DIM 함유 NGM 플레이트 1개를 준비했습니다.
2. 박테리아 또는 DIM 및 FITC-dextran Feeding 처리
   1. 20°C에서 64시간 동안 노화 동기화된 난자를 살아있는 대장균 OP50을 식품으로 보충한 NGM 플레이트에서 배양합니다.
   2. 연령 동기화된 L4 유충을 S-buffer로 세척하고 이들(약 500개 이상의 벌레)을 다른 박테리아와 화학 물질이 포함된 처리 NGM 플레이트로 옮깁니다. 20 °C에서 48 h.
      동안 배양하십시오. 참고: 사용된 박테리아와 화학 물질에 따라 치료 시간은 24시간에서 72시간까지 다양합니다. DIM의 치료 또는 예방 효과는 병원체로 기생충을 전처리한 다음 DIM(치료 효과)으로 기생충을 전처리하거나 DIM으로 기생충을 전처리한 다음 병원체로 처리(예방 효과)하여 평가할 수도 있습니다.
   3. FITC-덱스트란이 보충된 플레이트를 준비하려면 2mL의 열비활성화 대장균 OP50과 4mg의 FITC-덱스트란을 혼합합니다. 그런 다음 100μL의 FITC-덱스트란과 대장균 OP50 혼합물을 20개의 새로운 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)로 나누고 깨끗한 벤치에서 플레이트를 1시간 동안 건조시킵니다.
      참고: 각 NGM 플레이트에서 FITC-dextran의 최종 농도는 20μg/mL입니다.
   4. 차량 제어 처리를 위해 FITC-dextran이 없는 5개의 E. coli OP50 함유 NGM 플레이트를 준비합니다. 이를 위해 100μL 열 비활성화 대장균 OP50을 각각의 새로운 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)에 나누고 깨끗한 벤치에서 플레이트를 1시간 동안 건조시킵니다.
      참고: 각 독립 실험에 대해 15개의 FITC-dextran 보충 NGM 플레이트와 FITC-dextran이 없는 5개의 NGM 플레이트가 필요합니다.
   5. 처리 48시간 후(단계 2.2에서), S-buffer로 웜을 세척하고, 웜을 FITC-dextran 보충 플레이트와 FITC-dextran이 없는 NGM 플레이트로 옮기고, 플레이트를 밤새도록(14–15시간) 배양합니다(14–15시간).
      참고: 각 치료 그룹에 대해 FITC-dextran 염색(또는 비히클 대조군 공급)을 5회 반복
   해야 합니다.
   6. S-버퍼로 지렁이를 세척하고 신선한 NGM 한천 플레이트에서 1시간 동안 기어 다니도록 합니다.
      참고: 각 독립 실험에 대해 총 20개의 새로운 NGM 플레이트가 필요합니다. 이 단계에서는 E. coli OP50 없이 또는 E. coli OP50과 함께 보충된 NGM 플레이트를 사용할 수 있습니다.
   7. 50μL의 4% 포름알데히드 용액을 검은색 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 형광 측정을 위해 각 NGM 플레이트에서 각 웰로 약 50개의 웜을 이동합니다. 1-2분 후 각 웰에서 모든 포름알데히드를 철저히 제거하고 100μL의 장착 매체를 추가하여 웰을 코팅합니다.
      참고: 포름알데히드 용액(4%)은 벌레를 고정시키고 고정하는 데 사용됩니다. 각 처리 그룹에 대해 5개의 웰(5회 반복)이 이미지 분석에 사용됩니다.
3. Operetta 이미징 시스템을 사용한 예쁜꼬마선충 이미징 및 FITC-dextran 형광 흡수 측정을 통한 장 투과성 측정
   참고:형광 입체 현미경은 Operetta 시스템 대신 이미지 분석에 사용할 수 있습니다.
   1. Operetta High-Content Imaging System을 사용하여 형광 이미지를 캡처하고 형광 강도를 측정하고 Harmony 소프트웨어로 이미지를 분석합니다.
   2. Harmony 소프트웨어에서 아이콘을 누르십시오 뚜껑 열기 뚜껑을 열고 플레이트를 기계에 넣습니다.
   3. 매개 변수를 설정합니다.
   4. 설정을 클릭하고 플레이트 유형(96웰 corning flat-bottom)을 선택하고 채널(명시야 및 EGFP 채널)을 추가합니다.
   5. 레이아웃을 조정합니다. 레이아웃 선택으로 이동한 다음 추적을 선택하고 매개변수를 조정합니다(첫 번째 그림은 1μm, 평면 수는 10개, 거리는 1μm).
   6. 처리 웰 중 하나와 하나의 캡처 필드를 선택하고 테스트를 눌러 실험 실행 섹션에서 사진이 만족스러운지 확인합니다.
   7. 사진이 만족스러우면 설정 섹션으로 돌아가서 화면 끝에 있는 재설정 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 모든 대상 웰과 적절한 수의 포획 필드를 선택합니다.
   8. Run experiment(실험 실행)로 이동하여 플레이트 이름을 입력한 다음 Start(시작)를 눌러 처리를 시작합니다.
   9. 형광의 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 이동하여 이미지를 입력하십시오. EGFP 채널과 방법 B를 선택하여 셀을 찾습니다. 공통 임계값을 0.5로, 면적을 >200μm2로, 분할 계수를 3.0으로, 개별 임계값을 0.18로, 대비를 0.18 이상으로 조정합니다. 그런 다음 intensity 속성을 계산하고 평균을 출력값으로 선택합니다. Apply 아이콘을 눌러 설정을 저장합니다.
   10. Evaluation 섹션으로 이동하여 히트맵과 데이터 테이블을 가져와 강도를 측정합니다. Readout 매개변수를 Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well로 설정하고 평가를 시작합니다.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   11. Operetta에서 데이터를 추출하려면 설정 버튼을 클릭하고 데이터 관리를 선택합니다.
   12. 아카이브 쓰기를 선택한 다음 찾아보기를 열고 파일을 선택합니다.
   13. 파일을 선택하려면 왼쪽 모서리에 있는 작은 + 신호를 클릭한 다음 측정을 클릭하고 플레이트 이름을 선택합니다.
   14. 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다.
   15. 활성 경로에서 Browse 신호를 클릭하여 파일을 저장할 경로를 선택합니다.
   16. 시작을 클릭하여 데이터 파일을 저장합니다.
       참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
4. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 FITC-덱스트란 형광에 대한 통계적 분석
   1. 데이터를 가져오고 통계 소프트웨어를 사용하여 평균과 표준 편차(SD)를 계산합니다.
   2. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 유의한 차이를 분석합니다.

결과

그림 1: 녹농균을 먹인 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 장 투과성에 대한 DIM의 효과.(A) FITC-덱스트란 공급이 없는 대장균 OP50, (B) FITC-덱스트란 공급이 있는 대장균, (C) FITC-덱스트란 공급이 있는 P. aeruginosa PAO1, (D) 녹농균 및 FITC-덱스트란 공급과 함께 DIM(100μM) 병용처리의 기생충의 현미경 이미지. 눈금 막대 = 1mm(...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3,3'-디인돌릴메탄	시그마	D9568
90×15mm 페트리 접시	SPL Life Sciences, 대한민국	10090
Bactor 한천	벡턴 디킨슨	제품 코드 214010
포름알데히드 용액	시그마	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)		와일드 타입
콜레스테롤	시그마	C3045
Costa 분석 플레이트, 96 웰 블랙, 투명 플랫 바닥, 비 처리, 뚜껑 폴리스티렌 없음	코닝 주식회사	레퍼런스 3631
디메틸 설폭사이드	시그마	D2650
대장균 OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)
플루오레세인 이소티오시아네이트 - 덱스트란	시그마	FD10S
Harmony 소프트웨어	퍼킨엘머		버슨 3.5
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Fisher 생물 시약	BP2213-1
Fluoromount 수성 장착 매체	시그마	F4680
Operetta CLS High-Content 분석 시스템	퍼킨엘머	HH16000000
펩톤	머 크	재질 보기 EMD 1.07213.1000
녹농균 PA01	Korean Collection for Type Culture (유형 문화에 대한 한국어 컬렉션	KCTC 제1637호
염화나트륨	Fisher 생물 시약	BP358-1
스테레오 현미경	Nikon, 일본	SMZ800N