생식선 미세주입: 예쁜꼬마선충의 생식세포에 직접 화합물을 전달하는 방법

초록

출처: Farboud, B. et al, 다양한 세포 및 유기체에서 Cas9 리보핵단백질을 사용한 향상된 게놈 편집.J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세주입에 대해 설명합니다. 이 예에서는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 도입하는 데 사용되는 미세주입을 볼 수 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 Farboud et al, 다양한 세포 및 유기체에서 Cas9 리보핵단백질을 사용한 향상된 게놈 편집, J. Vis. Exp.(2018).

1. RNP 어셈블리

1. 모든 RNA, DNA 및 단백질 구성 요소를 미리 획득하여 실험을 미리 설계하십시오. 첫 번째 단계로, 표 1에 나열된 positive control 중 하나를 시도하고 Table of Materials에 설명된 상용 시약을 사용하여 신뢰할 수 있는 실험 설계와 재료의 무결성을 보장합니다. 새로운 게놈 편집 실험 계획에 대한 추가 팁은 이 주제에 대한 논문을 참조하십시오.
   참고: 다음 단계에서 설명한 대로 조립되면 미리 준비된 RNP는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
   1. 타겟 유전자를 선택한 후 무료 온라인 도구 중 하나를 사용하여 최적의 gRNA를 설....

결과

표 1: 예비 게놈 편집 실험을 위한 양성 대조군.이 표는 이 프로토콜에 설명된 각 세포 및 유기체에서 최초 게놈 편집 실험을 수행하는 데 필요한 주요 정보를 보여줍니다. 이러한 매개변수를 따르면 실험자가 자신의 관심 유전자를 표적으로 삼을 때 프로토콜을 테스트하거나 비교를 위한 기준선으로 사용할 수 있는 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다. F: 정방향, R: 후진, HDR: 상동성 지향 복구. 이 표의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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재료

<표 테두리="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1040px;" width="1039"> 이 논문에 사용된 재료 목록 이름 회사 카탈로그 번호 댓글 시약/재료 DNA 올리고 뉴클레오티드 통합 DNA 기술 - IDT는 표 1에 있는 것을 포함하여 맞춤형 DNA 염기서열을 제공합니다. 가이드 RNA 신테고 - Synthego는 표 1에 포함된 표적 염기서열을 포함하는 맞춤형 sgRNA를 포함하여 S. pyogenes Cas9에 대한 고품질 sgRNA를 제공할 것입니다 정제된 Cas9 단백질(EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) 뉴잉글랜드 생명과학 M0646T 가능하다면 Cas9를 사내에서 정제하거나 현지 핵심 시설에서 구입하는 것이 더 저렴한 옵션입니다. OP50 대장균 Caenorhabditis Genetics Center OP-50 https://cgc.umn.edu/ 페트리 접시에 있는 선충 성장 매체 한천 - - Stiernagle, T 참조(ref. 59) 필라멘트가 있는 표준 붕규산 유리 모세관: 4인치(100mm), 1/0.58 OD/ID World Precision Instruments 1B100F-4 단일 배럴 표준 붕규산 유리 모세관: 6인치(152mm), 2/1.12 OD/ID World Precision Instruments 1B200-6 커버 유리; 24 × 50 mm 써모 피셔 사이언티픽 12-544E 커버 유리; 22 × 22 mm 써모 피셔 사이언티픽 12-518-105K Apex LE 아가로스 제네시 사이언티픽 20-102 할로카본 오일 700 시그마-알드리치 H8898-100ML pCFJ90 플라스미드 애드진 19327 필라멘트가 있는 모세관 : 4 in (1.0 mm) World Precision Instruments T2100F-4 페트리 접시 (100 × 15 mm) - 9"파스퇴르 피펫 - 뉴클레아제가 없는 물 - 장비 MZ75 실체현미경 라이카 생산 중단. 현재 모델은 M80 실체현미경입니다. Axio Vert35 반전 위상차 형광 현미경 자이스 생산 중단. 현재 모델은 Axio VertA.1입니다. 레이저 기반 마이크로피펫 풀러(C. elegans 프로토콜용) 셔터 계기 FG-P2000 Picoliter Microinjector(C. elegans 프로토콜용) 워너 인스트루먼트 플리-100A 3축 조이스틱 오일 유압 micromanipulator 나리시게 인터내셔널 MO-202U 거친 조작기 나리시게 인터내셔널 MMN-1 마이크로로더 피펫 팁 에펜도르프 5242956003 NG-한천