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다음 프로토콜은 Farboud et al, 다양한 세포 및 유기체에서 Cas9 리보핵단백질을 사용한 향상된 게놈 편집, J. Vis. Exp.(2018).
1. RNP 어셈블리
- 모든 RNA, DNA 및 단백질 구성 요소를 미리 획득하여 실험을 미리 설계하십시오. 첫 번째 단계로, 표 1에 나열된 positive control 중 하나를 시도하고 Table of Materials에 설명된 상용 시약을 사용하여 신뢰할 수 있는 실험 설계와 재료의 무결성을 보장합니다. 새로운 게놈 편집 실험 계획에 대한 추가 팁은 이 주제에 대한 논문을 참조하십시오.
참고: 다음 단계에서 설명한 대로 조립되면 미리 준비된 RNP는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
- 타겟 유전자를 선택한 후 무료 온라인 도구 중 하나를 사용하여 최적의 gRNA를 설계하십시오. 녹아웃을 생성하려는 경우 엑손을 목표로 삼아야 합니다.
참고: 이러한 도구는 인접한 S. pyogenes PAM 염기서열, 고품질 점수 및 낮은 비표적 점수가 있는 표적 부위를 식별하는 데 도움이 됩니다.
- 발표된 방법을 통해 S. pyogenes Cas9 단백질을 정제하거나 상용 공급업체에서 구입하십시오.
- 20mM의 HEPES pH 7.5, 150mM의 KCl, 10% 글리세롤 및 1mM의 TCEP를 포함하는 RNA 희석, RNP 준비 및 단백질 저장을 위한 일반적인 Cas9 완충액을 준비합니다. 분해를 방지하기 위해 RNA를 재현탁하거나 희석하는 데 사용되는 완충액에는 항상 뉴클레아제가 없는 물을 사용하십시오.
- 발표된 방법을 사용하여 in vitro transcription을 통해 가이드 RNA(tracrRNA 및 crRNA 또는 sgRNA)를 생산하거나 핵산 합성 회사에서 구입합니다.
- 유전자를 삽입하는 경우 합성하거나 donor DNA template를 구매합니다.
- 단백질과 RNA 부분 표본을 -80 °C에서 보관하고 사용 직전에 얼음에서 해동하십시오.
참고: 동결-해동할 때마다 효율성이 약간 떨어집니다. Cas9 정제 및 sgRNA의 체외 전사를 위한 상세한 개방형 액세스 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있습니다.
- 예쁜꼬마선충 편집을 위한 RNP 준비: 20 μL의 최종 부피를 생성하기 위해 다음 시약을 추가하여 RNP 복합체를 조립합니다(최종 농도는 괄호 안에 표시됨): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), 필요한 경우 복구 템플릿(0.5 μM ssDNA 또는 최대 350 ng/μL dsDNA).
참고: Cas9 매개 DSB 템플릿 복구의 효율성은 dsDNA 복구 구조체의 농도에 비례합니다. 따라서 수리 템플릿의 농도가 높을수록 템플릿 수리가 더 효율적입니다. 그러나 350ng/μL 이상의 dsDNA를 함유한 혼합물을 주입하면 주입된 기생충의 생존력이 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서 dsDNA의 치사율을 최소화하면서 복구 효율을 극대화하기 위해 최대 350ng/μL를 초과하지 않는 dsDNA를 혼합하여 사용하는 것이 가장 좋습니다.
- co-CRISPR/co-conversion screening 접근법에 필요한 경우 여러 crRNA를 추가하여 여러 loci를 동시에 표적화할 수 있습니다. crRNA를 두 개 이상 추가할 때 각 crRNA를 마스터 mix에 순차적으로 추가합니다.
참고: 각 crRNA의 양이 같을 필요는 없으며, Cas9의 농도를 변경하지 않고 마스터 믹스에서 crRNA의 총 농도를 두 배로 늘리는 것조차도 특정 유전자 자리에서 돌연변이 유발 빈도를 방해하지 않는 것으로 보입니다. 예는 Paix et al.에 자세히 설명되어 있습니다.
- 피펫팅으로 혼합하고 RNP 용액을 16,000 x g에서 5초 동안 회전시켜 용액이 튜브 바닥에 수집되도록 합니다.
- 용액을 37 ° C에서 15m 동안 배양합니다.
- 1분 동안 16,000 x g에서 시료를 원심분리하여 얇은 구멍이 뚫린 미세주입 바늘을 막을 수 있는 미립자를 펠릿화합니다. 다음 단계에서 상층액을 사용합니다.
- C. elegans 준비
1. 마이크로주사 1일 전: 마이크로주사를 위해 아가로스 패드를 준비합니다.
- 물에 아가로스를 넣고 핫플레이트나 전자레인지에서 끓여서 물에 3%(w/v) 아가로스 용액을 만듭니다.
- 24mm x 50mm x 1.5mm 커버 유리 슬라이드를 테이블 위에 배치하고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에 작은(~15μL) 아가로스 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 위에 다른 커버슬립을 올려 아가로스 방울을 빠르게 평평하게 만듭니다. 아가로스가 굳어지도록 한 다음 커버슬립 중 하나를 제거합니다.
- 아가로스로 코팅된 커버슬립을 앞면이 위로 향하게 하여 탁자 위에 하룻밤 동안 건조시킵니다. 24시간 후 아가로스 패드를 깨끗하고 건조한 용기에 보관하십시오.
참고: 이러한 항목은 무기한으로 사용할 수 있습니다.
2. 미세 주입 바늘 당기기: 필라멘트(외경 1.0mm, 내경 0.58mm)가 있는 붕규산 유리 모세관을 사용하여 Mello 및 Fire57 및 기타 리소스를 기반으로 바늘을 당깁니다. 바늘은 즉시 사용할 수 있거나 점토 지지대로 보강된 깨끗하고 건조한 용기에 보관할 수 있습니다.
3. 벌레의 유지 관리를 위해 페트리 플레이트에 붓고 OP50 박테리아를 발견한 선충 성장 배지(NGM) 한천을 준비합니다(표준 예쁜꼬마선충 유지 관리 및 성장 배지 레시피에 대한 프로토콜은 Stiernagle 참조).
4. 미세 주입을 위해 벌레를 준비: 미세 주입 12-24시간 전에 L4 단계의 자웅동체를 OP50 박테리아가 있는 새로운 NG-한천 플레이트에 선택하고 20°C에서 밤새 배양합니다. 각 Cas9 타겟/주입 혼합물에 대해 플레이트에 ~30개의 웜을 선택합니다.
- 미세주입 당일: 1.2단계에서 준비한 RNP 용액 상등액을 당겨진 미세주입 바늘에 로드합니다.
- 1.2.4단계의 상층액을 당겨진 모세관 피펫에 피펫하고 모세관 피펫의 용액을 준비된 미세주입 바늘(일반적으로 0.1μL 미만 로딩)로 되메웁니다.
- 로드된 바늘을 미세 조작기에 부착된 미세 주입 장치에 장착합니다. 사출 장치 압력을 250kPa로 설정하고 밸런스 압력을 25kPa로 설정합니다.
- 로드된 바늘 끝을 다시 부러뜨려 날카로운 바늘 가장자리를 생성합니다. 15mm x 1.5mm x 24mm x 50mm 커버슬립 상단에 1.5mm x 1.5mm 정사각형 커버슬립을 놓습니다.
- 정사각형 커버슬립의 한쪽 가장자리를 할로카본 오일 700으로 오버레이합니다.
- 바늘을 오일에 넣고 15mm 정사각형 커버슬립 가장자리에 놓습니다.
- 손을 사용하여 현미경을 안내합니다.tage 및 커버슬립, 주입 페달/버튼을 누르면서 바늘 가장자리를 따라 슬라이드를 위로 닦습니다. 바늘 끝을 뒤로 부러뜨려 바늘에서 액체의 흐름을 증가시킵니다. 주입 혼합물이 바늘의 가장자리를 따라 위로 흐르도록 하여 ~1 기포를 형성하여 최적의 유속을 달성합니다.
- 미세 주입 12-24시간 전에 채취한 L4 벌레가 주입 당일 발달 단계에 있는 젊은 성인인지 확인합니다. OP50 박테리아가 없는 NG-한천 플레이트에 어린 성인 벌레를 선택하고 5분 동안 기어 다니게 합니다. 이렇게 하면 주입 패드로 이동하는 박테리아의 양이 줄어들어 바늘 막힘을 최소화할 수 있습니다.
- 아가로스 주입 패드/커버슬립을 해부 스코프에 놓습니다. 웜 픽을 사용하여 패드의 한쪽 가장자리를 따라 할로카본 오일의 작은 트랙을 놓습니다.
- 기름으로 코팅된 웜 픽을 사용하여 NG-한천 플레이트에서 여러 개의 웜을 들어 올려 기름 트랙으로 들어 올립니다. 속눈썹이나 고양이 수염과 같은 피펫에 가는 털을 붙이고 벌레를 평행하게 놓고 벌레를 아가로스 패드에 부드럽게 밀어 넣습니다. 미세 주입 절차에 익숙해질 때까지 한 번에 하나의 웜만 장착하고 주입하십시오.
참고: 건조한 아가로스는 벌레의 수분을 흡수하여 패드에 달라붙게 합니다. 따라서 지렁이가 건조될 수 있으므로 신속하게 작업해야 합니다.
- 제자리에 놓고 패드에 부착하면 웜 픽 끝에서 할로겐 오일(~20μL) 몇 방울을 더 떨어뜨려 웜을 오버레이합니다.
- C. elegans RNP 및 주입 후 치료를 사용한 생식선 미세 주입
미세주입 프로토콜은 Mello 및 Fire에서 채택되었으며 다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다.
- 장착된 웜이 있는 커버슬립을 주입 현미경에 놓습니다. 저배율(5X 대물렌즈, 10X 안구)에서 웜을 주사 바늘에 수직으로 배치합니다.
- 고배율(40X 대물렌즈, 10X 안구)로 전환하고 중후반 파키텐의 핵 근처 영역에 해당하는 생식선 팔에 인접한 바늘을 재배치합니다.
- 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 벌레에 대고 움직여 큐티클을 약간 누릅니다. 그런 다음 한 손으로 현미경 스테이지의 측면을 두드려 큐티클을 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 주입 페달/버튼을 누르고 생식선 팔에 주입 혼합물을 천천히 채우고 바늘을 제거합니다.
- 다른 생식선 팔에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 벌레가 주입되면 커버슬립/아가로스 패드를 제거하고 해부 현미경 아래에 놓습니다.
- 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 M9 버퍼를 웜 위에 피펫으로 웜의 오일을 제거합니다. 이 치료를 수행하여 한천에서 기생충을 풀어줍니다.
- 10분 후 벌레가 완충액 안에서 몸부림치기 시작하면 당겨진 모세관 피펫을 사용하여 OP50 박테리아가 있는 NG-한천 플레이트로 이동합니다. 벌레가 회복되어 움직일 때까지 20 ° C에서 2-3 시간 동안 접시를 놓습니다.
- 회수되면 OP50을 사용하여 웜을 NG-한천 플레이트로 개별적으로 옮기고 플레이트를 25°C 인큐베이터로 옮깁니다.
- P0 주입 된 벌레가 자라서 3 일 동안 자손을 낳도록합니다. F1 자손을 선별합니다.
- co-CRISPR 또는 co-conversion을 사용하는 경우, reference gene의 돌연변이 표현형을 가지고 있는지 여부에 따라 스크리닝할 후보 worm을 선택합니다. 이 표시된 웜을 OP50을 사용하여 새로운 NG-한천 플레이트로 개별적으로 옮기고 20 ° C에서 F2 자손을 낳을 수 있습니다 .
참고: co-CRISPR 스크리닝 또는 선택에 사용되는 표현형은 Cas9 편집의 성공에 대한 조기 추정치를 제공해야 합니다.
- co-CRISPR 표현형이 존재하지 않는 경우, positive control plasmid를 microinject하여 microinjection 효율을 개선하는 데 도움을 줍니다.
참고: 예를 들어, mCherry 태그가 지정된 MYO-2를 인코딩하는 주입 혼합물에 플라스미드를 포함하면 주입 효율을 평가하는 데 도움이 됩니다. pCFJ90을 성공적으로 주입한 기생충은 형광 인두를 가진 자손을 낳을 것입니다.
- F1 웜을 검사하여 원하는 편집 내용이 있는지 확인합니다. F1 mother를 96-well plate의 개별 well로 선택하고 lyse한 다음 삽입 특이적 PCR 증폭, DNA 염기서열 분석 또는 surveyor nuclease assay(CEL-1)를 통해 DNA를 검사합니다.
참고: 이러한 분석은 co-CRISPR/co-conversion 또는 기타 스크리닝 또는 선택 요법을 사용할 때 수행할 수 있습니다.
