UV 조사: 염색체 외 배열을 통합하는 방법

초록

출처: Mariol, M. C et al. 높은 투과 속도를 가진 염색체 외 어레이를 C. elegans 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜.J. Vis. 특급(2013).

전이유전자의 미세주입은 일반적으로 큰 염색체 외 배열을 가진 C. elegans 균주를 초래하며, 이는 전이유전자의 다양한 발현 및 전달을 초래합니다. UV 방사선 조사는 어레이의 염색체 통합과 보다 안정적인 전이유전자 전달을 유도할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Mariol et al, 높은 전송 속도를 가진 염색체 외 배열을 C. elegans 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜, J. Vis. Exp.(2013).

1. 형질전환 웜의 UV 조사 및 복구

1. 벌레 조사:
   1. 30-100마리의 형광 형질전환 L4 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다(플레이트당 15-20
   마리).
   2. 뚜껑을 제거한 상태로 플레이트를 UV 가교기에 놓습니다. 0.012 J/cm²에서 벌레를 조사합니다. 변형률은 UV에 다소 민감하며 결과는 사용된 UV 조사기에 따라 달라질 수 있습니다. 0.010-0.015 J / cm² 사이의 선량 범위를 테스트 할 수 있습니다.
2. 방사선 조사 후 웜 복구:
   1. 방사선 조사된 벌레가 담긴 플레이트를 15°C에서 밤새 회복을 위해 놓습니다.
   2. 살아 있는 동물의 수를 확인하십시오. 우리 손에서는 약 80-90%의 생존율이 효율적인 방사선 조사에 적합합니다.
   3. 방사선 조사된 동물을 자손이 발달 단계에 도달할 때까지 15-25°C에서 성장시켜 coinjection marker 발현을 관찰할 수 있습니다.

2. 통합 형질전환 라인의 분리

1. F1 동물 선택:
   1. 150-200마리의 형광 F1 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다. 고투과율 라인(≥80%)의 경우 100마리의 F1 동물로 충분합니다.
   2. 자손이 형광 F2 동물을 관찰하기에 적합한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트를 15-25°C로 유지하십시오.
   3. i) F1 동물이 불임 또는 죽었음을 나타내는 자손이 없거나, ii) F1 동물이 예상된 속도로 전이유전자를 전달하지 않았음을 나타내는 형광 F2 동물이 없거나 적음을 나타내는 모든 F1 플레이트를 폐기합니다. 이 단계는 빠르며 ≥75%의 형광 자손을 나타내는 F1 플레이트를 선택하기 위해 형광 F2 웜의 비율을 추정해야 하는 표준 프로토콜과 비교할 때 실질적인 이점을 나타냅니다(표 1).
2. F2 동물 선택:
   1. 선택한 각 F1 플레이트에서 4개의 형광 형질전환 F2 동물을 단일화합니다. 형광 전이유전자(예: mCherry, gfp 또는 dsRed)를 사용하는 경우, 이러한 동물이 통합 어레이에 대해 동형접합적임을 나타낼 수 있으므로 형광 수치가 높은 F2 웜을 선택합니다. F2 동물을 선택할 때 다음 단계에서 거짓 부정을 피하기 위해 알이나 유충을 가지고 다니지 않는 것이 중요합니다.
   2. 15-25 °C에서 F2 동물을 성장시킵니다.
3. 통합 형질전환 균주의 분리 및 검증:
   1. F2 플레이트에서 100% 형광 형질전환 F3 웜을 스크리닝합니다. 단일 비형광 웜의 존재는 플레이트를 버려야 함을 나타내기 때문에 화면은 매우 빠릅니다. 통합 전이유전자에 대한 F2 동물 동형접합은 100% 동형접합 형광 자손을 제공합니다.
   2. 전이유전자의 100% 유전을 확인하기 위해 선택된 플레이트에서 8개의 형광 F3 동물을 선별합니다. 이론적으로 이 단계에서는 한 마리의 동물을 선택하는 것으로 충분합니다. 그러나 방사선 조사는 벌레 생리학에 중요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이를 무작위로 유도할 수 있으므로 수정이 불가능하거나 건강하지 않은 동물을 선택하지 않기 위해 8마리의 형광 F3 동물을 선택하는 것이 필요할 수 있습니다.
   3. 가능한 경우 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 균주, 즉 다른 F1 동물에서 회수된 균주를 유지하십시오.

결과

표 1. C. elegans 게놈에 염색체 외 배열 통합을 위한 표준 프로토콜과 개선된 프로토콜의 비교.거의 동일한 빈도로 전달되는 2개의 통합되지 않은 전이유전자는 표준 또는 개선된 프로토콜을 사용하여 통합되었습니다. 가장 큰 차이점은 표준 프로토콜에서 모든 F1 플레이트의 자손 스크리닝을 수행하여 형질전환 F2 웜의 비율을 추정한다는 사실에 있으며, 이는 ≥ 75%여야 합니다. 이 단계는 특히 초기 전송 속도가 75%에 가까운 경우 시간이 오래 걸립니다. 개선된 프로토콜에서는 형질전환 F2 동물을 운반하는 각 F1 플레이트에서 4개의 F2 웜을 선별하고 자손(F3)에서 형질전환 웜을 100% 스크리닝하는 것으로 충분하며, 이는 신속하게 수행될 수 ...

재료

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